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【求助/交流】蛋白纯化失败了
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用Ni柱纯化的带Hisi标签蛋白，纯化率几乎为零，纯化后和纯化之前的蛋白样电泳条带几乎一样。杂蛋白太多了，纯化失败。我是这样做的：用Tris-Hcl （PH8.0 ）重悬菌体沉淀，超声破菌，取上清上样，因蛋白是可溶的。具体步骤： 纯水洗A、B管 A、B液分别洗A、B管道 上样 A液洗至基线平稳 B液洗脱 收集洗脱峰 另外：ni柱是实验室师姐留下的，不过已经再生过了。 怎么会出现这种情况，请大家帮忙分析一下，是我纯化方法不对吗？ |
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biowandy
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首先问你一个问题，你见到了洗脱峰没有？有没有实时检测仪仪器，比如国产核酸蛋白检测仪 或者是AKTA， 如果出现了峰值就是对的。 你是说b洗脱下来的部分电泳啥都没有， 还是有杂带？ 你没有表述清楚。 如果b洗脱的东西没有任何东西，说明没挂柱子， 另外用菌液直接电泳应该可以看到目的蛋白，一般重组蛋白都会很深的，比细胞本身的蛋白的含量高很多， 你首先要确认蛋白是否表达了。 如果表达了，就要考虑为啥不挂柱子？ 不挂柱子的现象很少，要么就是亲和柱有问题，要么就是你的蛋白的his没表达。有些构建的质粒 会意外终止， |
2楼2010-01-25 21:30:23
3楼2010-01-25 21:44:04
jasco
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