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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】带有酶切位点的引物的退火温度如何计算？
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sdspring

金虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】带有酶切位点的引物的退火温度如何计算？



引入酶切位点后的引物，其退火温度以整个引物的Tm值（往往较高）还是除去酶切位点后配对序列的Tm值为准计算？

两者有时差别挺大的。 谢谢！
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1楼 2010-01-11 08:45:28
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tianpingpe

新虫 (小有名气)
★ ★
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司马诸葛(金币+1,VIP+0): 1-11 15:06
按照去除酶切位点的部分计数，不与模板结合的地方计算tm值时不考虑
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2楼2010-01-11 14:10:47
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
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司马诸葛(金币+1,VIP+0): 1-11 15:06
我喜欢用逐步提高退火的方法做~~~往往条带单一
也就是一开始用去掉酶切位点的，后面用几乎是两步法的做
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3楼2010-01-11 14:14:05
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★ ★
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司马诸葛(金币+1,VIP+0): 1-11 15:06
我也一般首先以去除酶切位点的退火温度做5个循环。然后引物全长退火温度做25个循环
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2010-01-11 15:00:38
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xiangchou812

木虫 (小有名气)
★
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我用PCR克隆过五个片段，均使用2楼的方法。没有问题。但是三四楼的方法应该更好一点！
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5楼2010-01-11 16:30:31
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沙中清泉

木虫 (正式写手)
★
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我一般直接以引物合成单上的Tm值为准，再减五度（赛百盛合成的引物），一般都能P出来
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6楼2010-01-11 16:32:18
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sdspring

金虫 (初入文坛)
谢谢各位！

那么说要根据两种Tm值摸索两种退火温度喽？ 好像挺有难度的
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7楼2010-01-12 08:30:26
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sailormoon8623

★
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恩，三楼的有道理，一般都是前5轮降5度，这样引物匹配得好
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8楼2010-01-12 14:01:54
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