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sdspring

金虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】带有酶切位点的引物的退火温度如何计算?



引入酶切位点后的引物,其退火温度以整个引物的Tm值(往往较高)还是除去酶切位点后配对序列的Tm值为准计算?

两者有时差别挺大的。 谢谢!
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tianpingpe

新虫 (小有名气)

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司马诸葛(金币+1,VIP+0): 1-11 15:06
按照去除酶切位点的部分计数,不与模板结合的地方计算tm值时不考虑
2楼2010-01-11 14:10:47
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

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司马诸葛(金币+1,VIP+0): 1-11 15:06
我喜欢用逐步提高退火的方法做~~~往往条带单一
也就是一开始用去掉酶切位点的,后面用几乎是两步法的做
3楼2010-01-11 14:14:05
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主

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我也一般首先以去除酶切位点的退火温度做5个循环。然后引物全长退火温度做25个循环
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2010-01-11 15:00:38
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xiangchou812

木虫 (小有名气)


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我用PCR克隆过五个片段,均使用2楼的方法。没有问题。但是三四楼的方法应该更好一点!
5楼2010-01-11 16:30:31
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沙中清泉

木虫 (正式写手)


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我一般直接以引物合成单上的Tm值为准,再减五度(赛百盛合成的引物),一般都能P出来
6楼2010-01-11 16:32:18
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sdspring

金虫 (初入文坛)

谢谢各位!

那么说要根据两种Tm值摸索两种退火温度喽? 好像挺有难度的
7楼2010-01-12 08:30:26
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sailormoon8623


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恩,三楼的有道理,一般都是前5轮降5度,这样引物匹配得好
8楼2010-01-12 14:01:54
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