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guozilqh

铜虫 (初入文坛)

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[交流] 【求助/交流】扫描电镜生物样品制备方法

请教各位大虾，欲对培养细胞体进行扫描电镜观察，求样品制备方法。
之前曾做个一次，效果不好，因本细胞体带鞭毛，样品经处理后鞭毛丢失。
上次制样方法如下：离心——2.5%戊二醛固定——乙醇梯度脱水——加入媒介剂——二氧化碳临界点干燥——镀金膜——观察。
离心后细胞体团集在一起造成鞭毛脱落，因此想将细胞体分散固定在盖玻片上进行观察。因此请教各位有经验的同志分享一下实验经验。谢谢！
此外，样品干燥这一步能否使用冷冻干燥法或其他可以替代二氧化碳临界点干燥法。

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1楼 2010-01-08 11:16:31

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刘超_2009

2楼2010-01-08 11:31:05

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tianpingpe

新虫 (小有名气)

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专业: 环境微生物学

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1949stone(金币+5,VIP+0): 1-9 21:18

① 2.5%的戊二醛固定2h。
② 磷酸缓冲液（pH6.0，0.1M）清洗2-3次，每次15-30min。
③ 1%锇酸固定1h，蒸馏水清洗4次，每次15-30min。
④ 2%单宁酸处理2-24h（单宁酸能和锇酸结合，增加电子反差，增加更多锇酸分子与样品分子的结合）。
⑤ 蒸馏水清洗4次，每次15-30min。
⑥ 1%锇酸固定1h，蒸馏水清洗4次，每次15-30min。
⑦ 脱水：分别用50%、70%、80%、100%、100%的乙醇处理10min。
⑧ 叔丁醇-乙腈干燥法：75%叔丁醇，20min；100%叔丁醇，10min；叔丁醇-乙腈（2:1），10min；叔丁醇-乙腈（1:1），10min；乙腈（100%），10min。
⑨ 离子度膜。
⑩ 扫描电镜观察。
这个是我们做真菌的步骤，希望对你有帮助

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3楼2010-01-08 11:50:31

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yaodeyaode

木虫 (职业作家)

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引用回帖:

Originally posted by tianpingpe at 2010-1-8 11:50:
① 2.5%的戊二醛固定2h。
② 磷酸缓冲液（pH6.0，0.1M）清洗2-3次，每次15-30min。
③ 1%锇酸固定1h，蒸馏水清洗4次，每次15-30min。
④ 2%单宁酸处理2-24h（单宁酸能和锇酸结合，增加电子反差，增加更多锇酸分 ...

请教：

您做的丝状真菌吗？还是酵母?

我们实验室做丝状真菌，液体培养后，想收集菌丝团/菌丝球做电镜，感觉不是单个的细胞，是否可以做这样两种：

1、菌丝形态观察（单个菌丝形态观察），是否要把菌球打散？还是直接做？还是用固体培养的菌丝做，比液体培养的好？

2、直接用菌丝球做，观察菌球的结构

3、请问液体培养后，培养物进行离心，然后收集菌体后，再按你说的这些步骤做可以吗？

先谢谢！！

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4楼2010-01-09 13:08:57

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