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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】测序结果有酶切位点，但却切不出来
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mss332003

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】测序结果有酶切位点，但却切不出来

最近在做载体构建,我将270bp的目的片段，两端带 EcoR I 酶切位点，连接在表达载体上,经过PCR鉴定和公司测序显示连接上的序列是正确的,而且酶切位点也在，可是我把提出的质粒再酶切却怎么也切不开,用EcoR I 专用的buffer 也不行, 愁啊！！请亲爱的朋友们帮忙想想办法吧,先谢谢各位了啊!

[ Last edited by mss332003 on 2010-1-7 at 10:21 ]
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不要因为也许会分离，就不敢求一次倾心的相遇。
1楼 2010-01-07 10:17:36
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tianpingpe

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1.检查你的酶是否有问题，拿其他质粒切一下，检查一下
2，重新提取质粒
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2楼2010-01-07 10:48:48
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★
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你的质粒多大，切下来的片段有点小，片段太小了，即使切开了也不应定能看出来，确实有点困难啊，建议加大载体量，即使有切不开的不要紧，反正有切下来得就行。
    你切下来是干嘛用啊，如果只是为了验证，建议用EcoR I 酶和载体上的另外一个酶切位点，使切下来的片段大点就好看了。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
3楼2010-01-07 11:35:33
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powerfulliu

金虫 (小有名气)
★
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还有一种可能，你的质粒EcoRI位点在宿主体内被甲基化了。要验证是不是这个原因，可以将这一段用PCR扩增出来再酶切，看能否切开。或者将质粒转入无甲基化的宿主后再抽提出来切个试试。Good luck！
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4楼2010-01-07 13:24:03
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mss332003

铜虫 (初入文坛)

谢谢！

引用回帖:
Originally posted by tianpingpe at 2010-1-7 10:48:
1.检查你的酶是否有问题，拿其他质粒切一下，检查一下
2，重新提取质粒

酶没有问题，质粒也没问题，想其他办法了
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不要因为也许会分离，就不敢求一次倾心的相遇。
5楼2010-01-08 15:07:51
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mss332003

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-1-7 11:35:
你的质粒多大，切下来的片段有点小，片段太小了，即使切开了也不应定能看出来，确实有点困难啊，建议加大载体量，即使有切不开的不要紧，反正有切下来得就行。
    你切下来是干嘛用啊，如果只是为了验证，建议用 ...

质粒有13kb,确实只是为了验证，感觉没道理切不出来~~先照你的方法试一下了
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不要因为也许会分离，就不敢求一次倾心的相遇。
6楼2010-01-08 15:11:36
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mss332003

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by powerfulliu at 2010-1-7 13:24:
还有一种可能，你的质粒EcoRI位点在宿主体内被甲基化了。要验证是不是这个原因，可以将这一段用PCR扩增出来再酶切，看能否切开。或者将质粒转入无甲基化的宿主后再抽提出来切个试试。Good luck！

用PCR扩增出来的片段酶切吗？？不太清楚这要怎么切？？
本来已经是在无甲基化的宿主里了，好奇怪为什么切不出来~~谢了~~
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不要因为也许会分离，就不敢求一次倾心的相遇。
7楼2010-01-08 15:20:53
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