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schi

木虫 (小有名气)

schi

[交流] 【求助/交流】克隆转化

   大家好, 现在实验遇到困难,请教下大家!!
现在想克隆测序2k作用的片段,用的是Takara的pMD19-T Vector ,大肠杆菌用的是DH5α的, 是不是这个载体连2K的片段很难啊?做了几次,挑的白斑检测也没有目的带?
  救助!!!!
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695

木虫 (职业作家)


amisking(金币+1,VIP+0): 1-4 20:21
这个应该很容易的,没什么难的啊,要是白斑多的话,做什么对照了没有呢、还是好好检查下体系的问题吧
2楼2010-01-04 18:41:19
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schi

木虫 (小有名气)

schi

引用回帖:
Originally posted by 695 at 2010-1-4 18:41:
这个应该很容易的,没什么难的啊,要是白斑多的话,做什么对照了没有呢、还是好好检查下体系的问题吧

我的目的片段是2k左右啊.检测后的目的片段很多在500bp 还有的是400bp。。
这个是什么原因啊?
3楼2010-01-04 18:45:11
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 1-4 20:21
引用回帖:
Originally posted by schi at 2010-1-4 18:45:

我的目的片段是2k左右啊.检测后的目的片段很多在500bp 还有的是400bp。。
这个是什么原因啊?

连2Kb不存在问题。
连进去小片段?你做回收了吗?
Thank-you,so-blue.
4楼2010-01-04 19:27:57
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

★ ★ ★
amisking(金币+3,VIP+0): 1-4 20:31
连2kb的片段应该没有任何问题,只要你PCR回收没有什么问题的话,连接是没有问题的,你可以用15微升的体系连,16度 T4 DNA连接酶连接过夜再转化,不要用错抗体就行
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
5楼2010-01-04 20:28:23
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主

理论上你用蓝白斑筛选, 阳性率应该挺高的,pcr是不是条件不合适。要不你提质粒酶切看看吧,酶切要比PCR验证可靠,或者直接拿去测序
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
6楼2010-01-04 21:46:35
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)

是不是割胶回收后再连接的?据说不同的胶回收方法也影响连接的
漫洒英雄泪,相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行?一任俺芒鞋破钵随缘化!
7楼2010-01-04 22:20:17
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schi

木虫 (小有名气)

schi

引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2010-1-4 19:27:

连2Kb不存在问题。
连进去小片段?你做回收了吗?

我PCR扩增的是一条特异的带啊。。是回收后连接的啊。。挑了不少白斑,检测的时候都不是目的条带啊。。
8楼2010-01-05 10:47:21
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yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)

转化效率低可能是你的目的片断和载体的比例不合适,一般在作完菌落PCR后要做酶切鉴定,用M13 引物作菌落PCR会好一些,如果它能做出来,测序肯定没问题.
9楼2010-01-05 11:03:27
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mcheng

铜虫 (初入文坛)

连接2K片段到克隆载体理论上不存在问题,我们成功将10K的片段连到克隆载体和表达载体上。您如果实在有问题可联系中美泰和生物公司,中美泰和是一家提供专业分子生物学服务的公司。您可上www.taihegene.com 网站上看看,也可直接联系 程敏: 13426089553
10楼2010-01-05 13:58:45
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