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【求助/交流】高AT含量的PCR问题
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小弟最近有一个PCR始终做不出来，原因很可能就是这个片段AT含量太高。该片段常约3.15kb，AT含量高达64.2%，而且分布均匀，做了很多次没做出来，于是采取分段来做，还好把1800到3150做出来了，前面的1-1000左右也做出来了，但中间的1000到1800怎么也做不出来，我试过很多方法，比如使用长达30个碱基与模板配对的引物，然后提高退火温度，减少退火时间，减少酶的量，减少 引物的量，提高dNTP的量，等等，都试过了，始终只有一个500bp左右的非特异性条带出现，也不是很亮， 另外，序列里经常有4到5个重复的A在一起的情况，请各位大侠指点指点。 先谢过啦！ 简单总结下可能的原因： 1.AT含量太高 2.序列中有很多重复的A在一起 [ Last edited by chinosaur on 2010-1-3 at 22:56 ] |
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2楼2010-01-03 20:59:57
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7楼2010-01-04 12:40:34
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多谢楼上各位的指点，我再补充一些曾经尝试过的策略。 我设计的引物长达30个overlap，退火温度已经高达60了，酶的话我试过宝生物的PrimerStar和天根的Taq，以前一直用实验室自制的pfu，PCR程序除了标准程序还试过两点法，网上关于高GC问题的解决方案很多，但是基本没看到高AT问题的，也没有AT buffer，AT太高，最直接的问题就是很难得到特异性的结果，我好几次P出大小只有目的片段一半的条带，非常明显但没有正常条带那么亮，其次（也可能是主要）序列里四个到五个A或T连在一起的情况非常多。 至于加DMSO，甘油什么的我还没试过，因为之前一直看到说是用来解决高GC含量的。 也跟老板讨论过，老板的建议就是分成小段分别P出来，然后在拼在一起。我也是这么做的，但是剩下最后一段始终就弄不出来。 PS:我是从酵母基因组里P的，所以更加困难了。 [ Last edited by chinosaur on 2010-1-4 at 16:47 ] |
8楼2010-01-04 16:44:06