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gdongli8325

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】阳性克隆的挑选

把一个片段连接到一个载体中(含有M13位点),用自己设计的引物做菌落PCR,检测的菌落都是阳性的,但是用M13 正向引物和自己设计的反向引物检测,根本就没有条带,不明白这是为什么,不知各位虫友是否碰到类似问题?
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gyesang

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gdongli8325(金币+1,VIP+0): 12-29 21:36
amisking(金币+2,VIP+0): 12-29 21:37
那可能是你的PCR没有反应好吧,你自己的引物p出来的条带大小对么,如果你用M13的引物p的话,菌不要放太多,然后预变性5min,然后退火温度用55度,再试试看,祝你成功
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2009-12-29 21:25:17
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gdongli8325

铁杆木虫 (正式写手)

自己的引物P出来的片段大小是对的。我P M13和自己的反向引物是用的是特异引物的退火温度(59),变性10分钟。
3楼2009-12-29 21:36:33
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gyesang

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引用回帖:
Originally posted by gdongli8325 at 2009-12-29 21:36:
自己的引物P出来的片段大小是对的。我P M13和自己的反向引物是用的是特异引物的退火温度(59),变性10分钟。

不用变性那么长时间,变性那么长时间酶会吃不消,或者你先煮菌然后再配PCR体系然后反应
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4楼2009-12-29 21:53:15
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