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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】阳性克隆的挑选
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gdongli8325

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】阳性克隆的挑选

把一个片段连接到一个载体中(含有M13位点），用自己设计的引物做菌落PCR，检测的菌落都是阳性的，但是用M13 正向引物和自己设计的反向引物检测，根本就没有条带，不明白这是为什么，不知各位虫友是否碰到类似问题?
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1楼 2009-12-29 20:40:18
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gyesang

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★ ★ ★
gdongli8325(金币+1,VIP+0): 12-29 21:36
amisking(金币+2,VIP+0): 12-29 21:37
那可能是你的PCR没有反应好吧，你自己的引物p出来的条带大小对么，如果你用M13的引物p的话，菌不要放太多，然后预变性5min，然后退火温度用55度，再试试看，祝你成功
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2楼2009-12-29 21:25:17
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gdongli8325

铁杆木虫 (正式写手)
自己的引物P出来的片段大小是对的。我P M13和自己的反向引物是用的是特异引物的退火温度（59），变性10分钟。
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3楼2009-12-29 21:36:33
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gyesang

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引用回帖:
Originally posted by gdongli8325 at 2009-12-29 21:36:
自己的引物P出来的片段大小是对的。我P M13和自己的反向引物是用的是特异引物的退火温度（59），变性10分钟。

不用变性那么长时间，变性那么长时间酶会吃不消，或者你先煮菌然后再配PCR体系然后反应
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4楼2009-12-29 21:53:15
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