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huhu2182

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】酶切后质粒切胶回收问题请教

各位虫友们,请大家帮我解答一下,为什么我抽提出来的质粒浓度有100ng/ul,取其中的20ul进行双酶切,酶切体系如下:
   HindIII  1ul
     NdeI     1.5ul
     pET22b   20ul
     buffer      5ul
     ddH2O    22.5ul/50ul
     37度过夜酶切后进行胶回收(50ul全部上样),理论上说反应的质粒量应该有2ug,可电游后发现得到的质粒条带只有不到150ng 的亮度(我是用marker 相对定量的),这说明我得到的质粒的量只有不足150ng吗?这是为什么呢?谢谢大家的解答
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sj_wu

金虫 (正式写手)

★ ★
huhu2182(金币+2,VIP+0):恩,可能是这个原因,谢谢,是星活性 12-26 22:58
时间可能太长了,我切质粒从来没有过过夜,最长3小时足够了,时间太长酶会有说叫什么新活性,将质粒切成碎片。UV的照射会迅速降解DNA,双酶切3条带的亮度加起来和原来一条带相当。
3楼2009-12-26 19:27:30
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

只是相对定量,没有那么准确,够用的就可以了,你定量有意义吗?如果需要定量,建议用分光光度计,如果不够用的,建议你多酶切一点,多点几个样
2楼2009-12-26 17:05:25
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yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)

同意楼上.用NEB的酶一个小时就可以了,TAKALA的酶3个小时.
4楼2009-12-26 21:20:12
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lfgc8505

金虫 (小有名气)

可能在电泳的过程中有损失~


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
可能在电泳的过程中有损失~
顺便问一下,楼主,你在转化PET22B的时候是否遇到过转化后(BL21DE3),再提质粒,发现有好几条带,且各条带之间距离很大。
我最近也在使用这个载体。发现有很多奇怪的现象。有机会我们可以多讨论一下
,可以么?
5楼2009-12-26 23:06:51
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