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chenstones

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】求职!有关原核表达,诱导不表达

我最近在做原核表达。分别用了pQE-30和pET-28a载体,都用IPTG进行了诱导,但都没有表达。我的外源表达框sCAR-L测序正确,起始子和终止子也都加了,诱导温度和诱导时间都进行了摸索,但就是不表达,宿主细胞是跟载体对应,分别是M-15[pREP4]和BL21(DE3)。比较奇怪的是,我师姐用pQE-30为载体,表达出了sCAR-L-IL3,我比她的表达框更小,反而不表达,做了很多,摸索了很多,没有结果,很郁闷,希望各位虫友能帮帮忙,给点建议,非常感谢
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chenstones

木虫 (小有名气)

★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 12-23 12:20
片段长度无法改变了啊,已经设计好了,改变了,就达不到预期表达蛋白的作用。除了考染,western bolting我也砸过,也没有表达,也不知道为什么。对于您说的包含了它自身的信号肽,这个我不太清楚,您能具体说一下吗?
4楼2009-12-23 12:13:01
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plantst5928

铜虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
可能与你选取的基因片段有关系,我之前也是死活不表达,就改了一下片段长度就好了,你可以在缩短一些选取片段试试。
2楼2009-12-22 23:49:16
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tianpingpe

新虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+3,VIP+0): 12-23 12:20
1.你将你构建好的载体送去测序检测一下,看看有没有移码,阅读框是否正确。
2.你的酶如果可以测定活性的话,可以测定一下,还可以sds-page检测一下,也许表达了,表达量比较低,或者是包涵体。
3.你的是否包含了它自身的信号肽,有的时候信号肽也会影响表达
3楼2009-12-23 10:07:50
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tianpingpe

新虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
就是有的基因它有一个自身的一个信号肽,帮助它在野生型中表达。但是一般做异源表达的话,最好是把他自身的信号肽去掉。你可以在ncbi上面查一下你的东西是否有信号肽,或者查找相关文献
5楼2009-12-23 13:08:51
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