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zplipeng

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】基因克隆的高人们!!

基因克隆的高人们!
小弟有一个问题:
    反转录后得到的cDNA,经特异引物PCR只有一条特异带,于是想把它克隆到载体上,可以直接用PCR产物酶切连接吗?还是必须要经过琼脂糖凝胶电泳纯化后再酶切连接?感觉就这一条带,应该可以不去纯化了吧!!!!
万分感谢!!
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加油哦↖(^ω^)↗,O(∩_∩)O哈哈~
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liyong1981

金虫 (正式写手)


★ ★ ★ ★ ★
1949stone(金币+4,VIP+0):谢谢 12-17 17:38
zplipeng(金币+1,VIP+0):感谢! 12-18 15:04
建议:1,纯化后转化,效率高些
      2,PCR产物难免有混合物的。还有引物二聚体,你能保证就一条带?!你引物二聚体比你的目的带更容易连接上载体
      3.你还是反转录的,MGD,那就更不能省了!!!!
      4.有的时候试验还是不能省的
希望对你有所帮助~~~~~~~~。
2楼2009-12-17 14:42:55
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nasiyu

铜虫 (初入文坛)

3楼2009-12-17 15:35:32
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断弦的琴

铁虫 (小有名气)

★ ★ ★
1949stone(金币+2,VIP+0): 12-17 18:20
zplipeng(金币+1,VIP+0):感谢! 12-18 15:05
建议沉淀回收,效率一般在90%以上.酶切后一样的回收操作
不知道失去了多少以后我们能不再痛苦,不知道偿多少冷暖以后我们能看破生命.
4楼2009-12-17 15:36:00
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zzw1221

木虫 (著名写手)

★ ★ ★
1949stone(金币+2,VIP+0): 12-17 18:20
zplipeng(金币+1,VIP+0):谢谢啊! 12-18 15:05
纯化吧,这一步又不费时间的,呵呵免得后面搞不出来返工
5楼2009-12-17 15:41:52
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gastrodia

金虫 (正式写手)

★ ★ ★
1949stone(金币+2,VIP+0): 12-17 18:20
zplipeng(金币+1,VIP+0):谢谢啊! 12-18 15:05
酶切连接就不需要纯化
6楼2009-12-17 17:57:56
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xiangao

金虫 (正式写手)


zplipeng(金币+1,VIP+0):谢谢啊! 12-18 15:05
可以不用切胶回收,直接PCR产物纯化就行
7楼2009-12-17 18:24:20
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neon_alone

木虫 (小有名气)

其实电泳切胶回收和PCR产物纯化都可以的,不过觉得切胶回收比较保险,呵呵!
8楼2009-12-17 19:41:15
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suiliucai

金虫 (小有名气)

看你是用什么样的载体啊,有的载体就明确指出使用PCR产物连接的,有的载体连接最好切胶回收在连接
9楼2009-12-17 20:33:13
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louxinlong

木虫 (小有名气)

最好是电泳后回收,
10楼2009-12-17 21:23:32
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