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richenim金虫 (小有名气)
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[交流]
【求助/交流】细胞凋亡形态学观察 细胞爬片
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我最近在做细胞形体学染色观察，可是出现了些问题哦。希望高手能帮忙解决下哦 我是这样操作的： 1，将玻片置于六孔板，接种细胞 2，给药，24h后洗尽培养基，PBS洗2遍，加入2ml 3.7% 多聚甲醛固 定10min 3，弃去固定液，PBS洗3遍，每次3min，洗尽液体 4，加入1ml（10微克/ml）hoechest33342，37度培养15min PS: hoechest33342是用蒸馏水先配成1mg/ml，再用PBS稀释成10微克/ml后加入的。 有很多问题出现了：首先第一步中，接种细胞16小时后细胞在玻片上的贴壁效果不好，很多还是漂浮着。而且玻片下面不知怎么出现很多气泡，是不是我细胞爬片没做好，还是接种的细胞密度太大，还是其他什么原因。 第二步中，细胞固定10min后用PBS洗涤后感觉细胞没有完全固定，还是有漂浮的，不知道是不是固定的时间短了。最后加荧光染料，染色15min后，荧光显微镜观察荧光的强度很弱，我在想加入荧光染料染色后需不需要将液体弃去再观察？ 我的操作步骤有没有问题啊？ 做细胞凋亡形态学观察可不可以不用做细胞爬片，直接在板里接种，给药，荧光染料染色后观察啊？ |
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12楼2009-12-16 09:03:14
richenim
金虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
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- 性别: MM
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怎么都没人来帮忙解答一下哦！2楼2009-12-15 14:00:05
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richenim(金币+2,VIP+0): 12-15 21:56
richenim(金币+2,VIP+0): 12-15 21:56
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我也有做过细胞凋亡，就自己的经验说点，希望对你有所帮助 1、细胞贴壁不好可能也和细胞状态有关吧，还有，爬片没弄好，确实会在下面有气泡，不过，这个我觉得影响不是很大，我也碰到过这种情况，对最终结果影响不是很大。 2、细胞固定的话，我一般都是30min--60min的，有漂浮的话是避免不了的，因为加药之后细胞状态不好，贴壁不牢了，而且，细胞固定也不是说固定在爬片上的意思吧。 3、还有，你的hochest33342买来是粉末的吗？我看资料一般的荧光染料都不是用水来配置成高浓度的，好像是DMSO之类的吧，具体也不是很清楚 4、染色好了之后，PBS洗后，我一般都加80%甘油（PBS配制），不会让片子干着的 5、不知道你是用什么显微镜来观察荧光了，如果是倒置的荧光显微镜的话，你如果爬片做好了之后放在板里或者如你所说不做细胞爬片直接在板里进行的话，看的不是很清楚的，因为我们用的六孔板底部太厚了，不适合观察，可能低倍镜还看到，高倍镜下应该就看不到了的。 |
3楼2009-12-15 18:25:10
lzhwin
木虫 (正式写手)
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4楼2009-12-15 19:22:00