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【求助/交流】厌氧细菌保种方法
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| 请问厌氧细菌的保种方法，计数方法 |
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2楼2009-12-11 15:23:09
3楼2009-12-11 20:56:19
yueluohua
管理员
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穿刺接种试管内 再放进4摄氏度冰箱密封保存 计数法： 1.液体培养基中的细菌数量计数：定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。测定悬液中的菌数量并记录 2.菌落计数法（倒平板法）：1）取样 用移液器分别吸取每支试管悬液各1ml,梯度稀释至10-8，取每部分该浓度的菌液加入灭菌并编号的平板中，每个平板0.2mL。 2）倾注培养 A．将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。 B．待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。 C．倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。 D．倾注培养基的量取15ml，倾注时，培基底部如有沉淀物，将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。 E．为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。。 F．培养温度一般为37℃（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30℃）。培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15％。 G．为了避免培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4℃环境中放置，以便计数时作对照观察。 3) 计数 A．操作方法：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算处原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。 B．到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。 C．计数时应选取菌落数在30~300之间的平板（SN标准要求为25~250个菌落），若有二个稀释度均在30~300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。 D．若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。 E．不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错，不应作为检样计数报告的依据。 F．当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。 G．当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。 H．菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1~100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm）报告。 参考文献：1. GB4789.2-94《中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》 2．SN0168-92 《中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口食品菌落计数》 [ Last edited by yueluohua on 2009-12-14 at 22:27 ] |
4楼2009-12-14 22:21:14
5楼2009-12-17 10:40:41
stnj
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brightfuture01
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