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求助酶的几个简单小问题
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1.所有酶都分解双氧水吗？ 2 含铁或其他金属的蛋白质或酶与双氧水生成羟基自由基 or 催化双氧水的分解？ 3 如何测蛋白质的羰基含量，求简单的方法及制样方法。 本帖关键词：羰基 羟基 双氧水 蛋白质 金属 |
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4楼2009-12-03 15:02:04
qingfengwu
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qingfengwu
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第三个问题的方法学。
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bian416(金币+3,VIP+0): 12-3 14:53
bian416(金币+3,VIP+0): 12-3 14:53
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第二篇 2,4-二硝基苯肼比色法 8 原理 总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸,样品中还原型抗坏血酸经活性炭 氧化为脱氢抗坏血酸,再与2,4-二硝基苯肼作用生成红色脎,根据脎在硫酸溶液中的含量 与总抗坏血酸含量成正比,进行比色定量。 9 试剂 本实验用水均为蒸馏水。试剂纯度均为分析纯。 9.1 4.5mol/L硫酸: 谨慎地加250mL硫酸(比重1.84)于700mL水中,冷却后用水稀释至 1000mL。 9.2 85%硫酸：谨慎地加900mL硫酸(比重1.84)于100mL水中。 9.3 2%2,4-二硝基苯肼溶液:溶解2g2,4-二硝基苯肼于100mL4.5mol/L硫酸内,过滤。 不用时存于冰箱内,每次用前必须过滤。 9.4 2%草酸溶液:溶解20g草酸(H2C2O2)于700mL水中,稀释至1000mL。 9.5 1%草酸溶液:稀释500mL2%草酸溶液到1000mL。 9.6 1%硫脲溶液:溶解5g硫脲于500mL1%草酸溶液中。 9.7 2%硫脲溶液:溶解10g硫脲于500mL1%草酸溶液中。 9.8 1mol/L盐酸:取100ml盐酸,加入水中,并稀释至1200mL。 9.9 抗坏血酸标准溶液:溶解100mg纯抗坏血酸于100 mL1%草酸中,配成每毫升相当于1mg 抗坏血酸。 9.10 活性炭:将100g活性炭加到750mL 1mol/L盐酸中,回流1～2h,过滤,用水洗数次, 至滤液中无铁离子(Fe3+)为止,然后置于110℃烘箱中烘干。 检验铁离子方法:利用普鲁士蓝反应。将2%亚铁氰化钾与1%盐酸等量混合,将上述 洗出滤液滴入,如有铁离子则产生蓝色沉淀。 10 仪器和设备 10.1 恒温箱：37 ±0.5℃ 。 10.2 可见-紫外分光光度计。 10.3 捣碎机。 11 操作步骤 11.1 样品的制备 全部实验过程应避光。 11.1.1 鲜样的制备:称100g鲜样和100g2%草酸溶液,倒入捣碎机中打成匀浆,取10～40g 匀浆(含1～2mg抗坏血酸)倒入100mL容量瓶中,用1%草酸溶液稀释至刻度,混匀。 11.1.2 干样制备:称1～4g干样(含1～2mg抗坏血酸)放入乳钵内,加入1%草酸溶液磨成匀 浆,倒入100mL容量瓶内,用1%草酸溶液稀释至刻度,混匀。 11.1.3 将(11.1.1)和(11.1.2)液过滤,滤液备用。不易过滤的样品可用离心机沉淀后, 倾出上清液,过滤,备用。 11.2 氧化处理：取25mL上述滤液,加入2g活性炭,振摇1min,过滤,弃去最初数毫升 滤液。取10mL此氧化提取液,加入10mL2%硫脲溶液,混匀。 11.3 呈色反应 11.3.1 于三个试管中各加入4mL稀释液(11.2)。一个试管作为空白,在其余试管中加入 1.0mL2%2,4-二硝基苯肼溶液,将所有试管放入37±0.5℃恒温箱或水浴中,保温3h。 11.3.2 3h后取出,除空白管外,将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温, 然后加入1.0mL2%2,4-二硝基苯肼溶液,在室温中放置10～15min后放入冰水内。其余步骤 同样品。 11.4 85%硫酸处理：当试管放入冰水后,向每一试管中加入5mL 85 %硫酸,滴加时间至 少需要1min,需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出,在室温放置30min后比色。 11.5 比色：用1cm比色杯,以空白液调零点,于500nm波长测吸光值。 11.6 标准曲线绘制 11.6.1 加2g活性炭于50mL标准溶液中,摇动1min,过滤。 11.6.2 取10mL滤液放入500mL容量瓶中,加5.0g硫脲,用1%草酸溶液稀释至刻度,抗坏血 酸浓度20μg/mL。 11.6.3 取5,10,20,25,40,50,60mL稀释液,分别放入7个100mL容量瓶中,用1%硫脲溶液 稀释至刻度,使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1,2,4,5,8,10,12μg/mL。 11.6.4 按样品测定步骤形成脎并比色。 11.8.5 以吸光值为纵坐标,以抗坏血酸浓度(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线。 12 计算 c•V 100 X=━━━━━×F×━━━━ ............................(2) m 1000 式中：X─—样品中总抗坏血酸含量,mg/100g; c─一由标准曲线查得或由回归方程算得“样品氧化液”中总抗坏血酸 的浓度,μg/ mL； V─—试样用1%草酸溶液定容的体积,mL； F──样品氧化处理过程中的稀释倍数； m──试样质量,g。 13 结果的允许差 同一实验室平行或重复测定相对偏差绝对值≤10%。 |
3楼2009-12-03 12:37:25
