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elalei1999

铜虫 (小有名气)

[交流] 引物求助

Xba1-R:gct cta gat caa acN acN ggN gtt aaN aga g
Sma1-F:tcc ccc ggg atg gag gcg atH ggN gtt Ytg atg,
上下引物如上。Tm值相差10,采用了温度梯度50-55,退火时间30s,PCR后没有目的基因条带出现。只是在53度的二聚体较亮,其他次之。自己分析问题有以下:1、引物问题。引物过长,Tm值相差过多
2、模板问题。RNA提取有污染,降解,反转后的质量差。

请大伙指点迷津。谢谢。
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elalei1999

铜虫 (小有名气)

望高人回帖!
不抛弃,不放弃!
2楼2009-12-01 14:54:41
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qianggene

铜虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
可能原因,一是你的引物设计不好,如你所说,Tm值相差过多,而且引物设计最好避免GC或AT聚集;另外,你的目的片段多长?看看延伸时间是否够长。
3楼2009-12-01 15:28:00
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elalei1999

铜虫 (小有名气)

谢楼上。
再问“GC或AT聚集”怎讲,请在我的引物上指出。
目的片断在1000左右,延伸时间设的1min。
不抛弃,不放弃!
4楼2009-12-01 15:40:09
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linxi8579

铜虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
据说两条引物的Tm差也就是1度左右吧,你的十度怕是差距也太大了。P的结果可想而知,我觉得主要原因应该在这里,重新设计引物吧。好像一般避免3端比如A、T不可连续3个,易突变,G、C不可连续3个,结合太紧。别的地方保证整体上GC含量就可以了吧。
5楼2009-12-01 17:03:28
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