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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 双酶切的载体也能自连……
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mourning

木虫 (正式写手)

[交流] 双酶切的载体也能自连……

如题，不相干的位点了，也能自连起来，不可思议，转化效率还很低，不知连接体系是不是有问题，怎么办呢？
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1楼 2009-11-28 17:24:02
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goodwish

木虫 (正式写手)

木虫书呆子
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amisking(金币+3,VIP+0): 11-29 22:41
一般会是酶切的问题。可能是其中一个酶不太好用，没切完全。有些酶的切割效率很低。比如说我曾经用过NEB的sacII的酶，死活切不开。
切载体后一定使用切胶回收。
可以用单酶切检测一下两种酶切割的活性。
曾听过NEB的一个技术讲座，他们说如果克隆构建不好，极少是连接的问题，一般问题都出在酶切上面。连接酶的活性很高。不用过多的怀疑连接。

[ Last edited by goodwish on 2009-11-29 at 10:09 ]
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生命的海洋里，我是蓝色的一滴
6楼2009-11-29 10:02:30
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普通回帖

zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
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amisking(金币+2,VIP+0): 11-29 08:53
引用回帖:
Originally posted by mourning at 2009-11-28 17:24:
如题，不相干的位点了，也能自连起来，不可思议，转化效率还很低，不知连接体系是不是有问题，怎么办呢？

双酶切的载体一般是不会发生自连的，你用的是不是同尾酶呢？
你判断的转化效率低是不是阳性转化板和阴性对照长出的克隆数差不多呢？如果是的话应该是连接的有问题。
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2楼2009-11-29 01:01:09
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
有一个位电没有切好
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3楼2009-11-29 07:22:01
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j2

木虫 (正式写手)
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amisking(金币+1,VIP+0): 11-29 22:41
去磷酸化吧
理论上不该连，但实际就是有，我也奇怪为什么，望高手指点
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
4楼2009-11-29 09:26:53
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changes

木虫 (正式写手)
★
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可能是酶切出了问题，分步酶切试试。
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5楼2009-11-29 09:57:17
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
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酶切不彻底，或者酶切的黏端降解成平端自连
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7楼2009-11-29 10:18:16
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mourning

木虫 (正式写手)
回收了，插入片段也能连进去，PCR检测也有自连的空载体，很烦…
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8楼2009-11-29 10:24:52
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)
酶是同一种buffer?
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9楼2009-11-29 20:56:19
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nicknelson

至尊木虫 (职业作家)
同尾酶。。。
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10楼2009-11-30 00:25:09
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