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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 重组质粒pcr的假阳性
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)

[交流] 重组质粒pcr的假阳性

在转化板上挑取单克隆，液体培养后提取质粒。
奇怪的是电泳显示没有提取到条带，都是弥散的。
用这样的“质粒”样品做pcr验证，得到了很亮的目的条带
想请问大家，是假阳性的概率大不大？
为什么会造成这样的结果呢？

ps：插入的目的片段是个小片段。
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1楼 2009-11-27 09:58:23
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
测序，搞定……
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2楼2009-11-27 10:15:12
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grief

铜虫 (初入文坛)
★ ★
1949stone(金币+2,VIP+0): 11-27 16:28
我做的也是个终止子的小片段插入，菌落PCR结果很亮，阴性对照也出现了目的条带，就是酶切切不出来，做了许多次都郁闷了。现在改了实验方案，把终止子后面加了些，总共600多bp，再看情况会怎么样？
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等待秋天
3楼2009-11-27 10:33:00
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★ ★
1949stone(金币+1,VIP+0): 11-27 16:28
wordsworth3180(金币+1,VIP+0):xiexie 11-29 20:57
还是测序看看吧，另外可以换个试剂盒试试，看是否是试剂盒的问题。
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Thank-you，so-blue.
4楼2009-11-27 10:59:03
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漫迹

金虫 (小有名气)
★ ★
1949stone(金币+1,VIP+0): 11-27 16:29
wordsworth3180(金币+1,VIP+0):3q 11-29 20:58
是不是质粒提取的操作有的地方不对啊，提出的质粒不是很纯，或者是电泳的影响也有可能吧
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5楼2009-11-27 13:28:51
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)
是手工提的质粒，没有用试剂盒。
质粒也不大。
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6楼2009-11-27 15:30:26
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)
唉 不知道怎么回事
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7楼2009-11-29 20:58:52
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
楼上：
建议：1。质粒电泳是snear状，说明你的质粒转进去的不多
2.PCR扩增初目的带，很正常啊，因为你还是有部分转进去的，虽然模板浓度低，但要知道PCR是指数级增长的，所以阔的出来
3.平板挑进去液体培养基这步，怀疑有问题，是否存在选择压不够的问题
4.建议从新做一遍、
希望对你有帮助
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8楼2009-11-30 11:42:53
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2009-11-30 11:42:
楼上：
建议：1。质粒电泳是snear状，说明你的质粒转进去的不多
2.PCR扩增初目的带，很正常啊，因为你还是有部分转进去的，虽然模板浓度低，但要知道PCR是指数级增长的，所以阔的出来
3.平板挑进去液体培养基这 ...

谢谢楼上的建议 就是酶切连接转化都重新做么？
因为转化菌长的慢，所以自己也很不确定，平板是刚做的，怎样控制强的筛选压力呢？
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9楼2009-11-30 19:27:20
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yangguoliguo

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你的质粒提取完成后跑胶，最好出现三条带，离点样孔最近的的是提取过程中破碎的片段，依次是开环产物，跑的最快的环状质粒也是你所需要的。
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天行健，君子以自强不息地势坤，君子以厚德载物
10楼2009-11-30 20:21:05
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