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刘仕博

金虫 (著名写手)

[交流] 说说我试验的时候遇到的那些破事,还请real time-PCR的高手多指教!

从不知道引物是什么到现在实验做的挺顺手一共也就一个月的时间。但咱不是实验员,光实验做的顺手也不是那么回事情。先和大家磨叨下吧~
因为现在实验室里面都是一群死脑筋的韩国人,所以从他们那学到的东西也就很死板。找real time用的引物就一定要用real time专用的软件,退火温度一定要是60度。。。。。。搞的我一天的为引物测试而发愁,一旦发现引物不对或者扩增效率不够好就只想着换引物。后来我做了一次一般的PCR发现有的引物虽然有二级结构,但还是能用的,而且结果还不错。所以我就想着可能改下温度或者引物的量的话好像也是可以做出来的。
今天我就第一次换了个温度做了一次引物测试,结果有几个以前扩增效率不好的引物也变的可以用了,但有几个还是很不理想。最要命的是我的内参在60度的时候可以用,58度的时候扩增效率就不好了。我就又增加了引物的量,希望这次能成功。如果这次还不成功的话我就真的不知道还有什么办法了。
还请高手们多多指点下。。。
先谢啦~
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生命在于折腾~
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695

木虫 (职业作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
bless you, you are great
2楼2009-11-26 17:41:51
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刘仕博

金虫 (著名写手)

thank you anyway~
生命在于折腾~
3楼2009-11-26 18:25:31
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09021122

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
虽然不是很了解,但是相信楼主定能克服困难,获得成功!!!
雄关漫道真如铁,而今迈步从头越
4楼2009-11-26 18:42:46
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安宁

铁虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
做RT-PCR最重要的是调好内参,如果内参效果不好,那所有的数据都没有任何意义了。还是要先保证内参
5楼2009-11-26 19:29:55
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刘仕博

金虫 (著名写手)

之前在60度的时候内参的效果是可以的。今天换58度P了一次,扩增效率不行。增加了引物的量,出来的结果更奇怪。按道理讲58度的时候内参也应该可以的呀。我现在都不知道该怎么办好了~
生命在于折腾~
6楼2009-11-26 20:28:14
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cato8163

银虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
小可,当时做的时候,主要是考虑引物二聚体。适当减少引物的量,效果还是不错的。也是采用了二步法。支持5楼的,内参重要。祝好运。
7楼2009-11-26 21:30:34
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