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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 新手请教如何对不同物种中某一酶的氨基酸序列进行比对再设计简并引物啊？
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vegetking

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 新手请教如何对不同物种中某一酶的氨基酸序列进行比对再设计简并引物啊？

我想克隆一个酶的基因，在其它物种中有。通过看相关文献，基本思路是，先分析找到该酶在不同物种中的氨基酸保守序列，再根据其设计简并引物，扩增出基因的保守序列，再通过3'、5'RACE扩增出其全长。好象也就是所谓的同源克隆吧。但是如何对该酶在不同物种中进行氨基酸比对，从而筛选出在不同物种中具有高度保守的氨基酸序列呢？
我刚接触分子，不怎么懂。问实验室的师兄师姐们，不知道是觉得太简单呢，还是也不懂，反正也说不出个所以然。
在此请教各位高手了！请不要见笑啊！
再次感谢！
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新十八子
1楼2009-11-23 21:27:00
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vegetking

铁杆木虫 (正式写手)
怎么没有高人出手啊？太简单了么？
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新十八子
2楼2009-11-24 10:12:53
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by vegetking at 2009-11-23 21:27:
...

你问的是理论方面的问题还是具体的方法呢？
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漫洒英雄泪，相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行？一任俺芒鞋破钵随缘化！
3楼2009-11-24 16:35:45
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安宁

铁虫 (初入文坛)
★
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网上就可以比对，有的文献中可能已经做过相关研究，该文献中可能会有现成的引物
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4楼2009-11-24 18:42:57
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qianggene

铜虫 (小有名气)
你是否已经拿到中间片段了？还有，是否在数据库中搜到了其他物种的该基因？
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5楼2009-11-24 18:58:25
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vegetking

铁杆木虫 (正式写手)
谢谢了！
这两天在狂看相关文献，可能缺乏相关背景知识，看不大懂！
我就是想先分析保守氨基酸，设计简并引物，克隆出中间片段，然后再通过3‘、5RACE得到全长序列啊！基本思路应该是这样的吧？’
有一些人做过相关酶的，但是我这种植物极少有人做分子方面的，所以想借鉴别的植物，并做些代谢途径方面的酶的情况研究。别的植物的简并引物直接可以拿过来直接用么？我看了其中一篇，他和烟草、马铃薯、拟南芥、紫花苜蓿等保守性相当高的啊！我研究的对象和它们亲源关系很远的，恐怕不能直接用吧？
再次感谢！
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新十八子
6楼2009-11-25 17:33:41
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qingfengwu

金虫 (小有名气)
★
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使用vector NTI软件，把不同源性的蛋白质序列输入，对这些序列进行align，就可以找出这些保守的氨基酸序列，有可能有多个。
我不赞同你说的只是克隆一部分保守序列，这样的序列没有什么功能，我认为你应该选择一种最重要的物种，根据它的CDS进行克隆，制造出wild type的克隆质粒，然后对这些保守的序列进行分析，如果认为保守序列是功能domain，那么在wild type克隆的基础上，对那些保守的功能序列进行突变，就可以得到dominant negative 的克隆，就可以用两种质粒进行功能研究了。
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7楼2009-11-26 00:37:06
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vegetking

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by qingfengwu at 2009-11-26 00:37:
使用vector NTI软件，把不同源性的蛋白质序列输入，对这些序列进行align，就可以找出这些保守的氨基酸序列，有可能有多个。
我不赞同你说的只是克隆一部分保守序列，这样的序列没有什么功能，我认为你应该选择一 ...

谢谢您了！
不是太明白您说的。我看了一些相关文献，比如说要克隆我所研究的物种中多酚氧化酶基因，好象多是分析保守氨基酸序列，据此设计简并引物，PCR出cDNA中间片段，再根据此片段进行3‘、5’RACE进行PCR得到全长。这样可以么？
但是我不知道怎么分析得到不同物种中的保守氨基酸序列，做过几个物种的比对，用GENEFISHER和DNAman,但是没有成功，要么没有保守序列，要么没有得到引物。难道选择进行保守分析的物种有什么要求么？
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新十八子
8楼2009-11-26 18:43:54
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