| 查看: 59 | 回复: 0 | |||
科研战神来了新虫 (小有名气)
|
[交流]
做 WB 栽在组织提蛋白上？这份实操经验收好
|
|
今天给大家分享组织样本蛋白提取实操流程，适配 WB 实验，整套操作围绕低温环境开展，降低蛋白降解风险。 一、实验前期准备提前备好预冷的RIPA 裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、BCA 蛋白定量试剂盒、5× 蛋白上样缓冲液（loading buffer）、无菌 EP 管、组织研磨珠、组织研磨仪、高速冷冻离心机。提前开启离心机预冷至4℃，准备冰盒，后续所有操作在冰上完成。 二、组织称重与裂解液配制称取30 mg新鲜或者冻存组织样本。按照1:15的比例加入裂解液，本次样本加入450 μL裂解体系。裂解液现配现用，配比为RIPA: 蛋白酶抑制剂：磷酸酶抑制剂 = 100:1:1。实验不检测磷酸化修饰蛋白时，可以省去磷酸酶抑制剂。 三、组织研磨破碎将组织、裂解液、研磨珠一同放入 EP 管，放置于组织研磨仪。设置参数30 Hz，单次研磨50 s，重复研磨3～5 次，直到管内组织完全变为匀浆状态。研磨间隙可以短暂放置冰上降温，避免研磨产热造成蛋白降解。 四、冰上裂解孵育研磨结束后，将 EP 管置于冰上静置30 min，让组织充分裂解。期间可以每隔 10 min 轻柔颠倒混匀一次。 五、离心取上清使用预冷好的高速离心机，4℃、12000 ×g条件离心20 min。离心结束后小心吸取上层澄清液体，转移至新的预冷 EP 管。吸取上清时避开上层白色脂肪层和底部沉淀，不要吸入杂质。 六、BCA 蛋白浓度测定预留少量蛋白原液，稀释 10 倍，组织蛋白浓度普遍偏高，稀释后再检测，避免超出标准曲线范围。按照 BCA 试剂盒说明书操作，测定各组蛋白浓度。 七、蛋白样本归一化以所有样本里最低蛋白浓度为基准，统一调整各组蛋白体积，实现蛋白上样量归一化，保证后续 WB 内参条带对齐。八、蛋白变性处理按照试剂盒说明，加入对应体积的 loading buffer。混匀后进行变性处理，常规蛋白100℃水浴加热 10 min。部分膜蛋白不耐受高温，可调整变性温度，或者省略煮沸步骤。九、分装保存变性完成后，将蛋白样本分装至多个 EP 管，标记好样本信息，放入**-80℃**冰箱储存。分装可以减少样本反复冻融的次数，防止蛋白降解。 |
回复此楼» 猜你喜欢
激荡学术火花，赋能青年成长，Biofunctional Materials青年编委招募
已经有18人回复
-
激荡青年思想，深耕生物材料，Biofunctional Materials 青年编委招募开启！
已经有7人回复
-
生物物理、生物化学与分子生物学论文润色/翻译怎么收费?
已经有291人回复
-
赋能青年学术发声，携手打造前沿特刊，Biofunctional Materials 青年编委全球招募
已经有7人回复
-
院士领衔，ICBMBA生物功能材料与生物医学应用会议诚邀学者加入！
已经有6人回复
-
ICBMBA 2026，生物功能材料与生物医学应用国际会议诚邀参与！
已经有5人回复
-
Interdiscipline 2026，2026国际交叉学大会，多学科诚邀参会，院士领衔，专家云集
已经有5人回复
-
【PhD 招生 | La Trobe University | 有机合成 / 化学生物学 / 多肽化学】
已经有24人回复
-
聊聊生物材料课题从合成到验证的那些事
已经有0人回复
-
【科普】医工交叉漫谈：水凝胶凭什么成为组织修复热门材料？
已经有0人回复
-
重磅邀约｜2026 生物医药产业发展大会
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
