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甲基化测序数据里，还藏着癌细胞的融合线索！
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在肿瘤研究中，甲基化测序可以帮助研究人员分析癌细胞的调控状态，为肿瘤分型提供线索。同时，研究人员为了了解肿瘤发生发展的分子机制，还会研究同一个样本中是否存在特定的融合基因。那么能不能从同一份测序数据中获得甲基化和基因融合两类信息呢？这样就有机会从有限的样本中获得更多有价值的信息。 全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）提供了一种可能。它在检测甲基化状态的同时，也读出了大量DNA片段的序列。当某些读段跨过两个基因异常连接的位置时，就可能留下基因融合的证据。因此，已经完成WGBS的肿瘤样本，有机会通过进一步分析，获得额外的融合信息。 2026年3月，韩国延世大学Taehoon Kim和Duhee Bang在《Scientific Reports》发表研究，探索了这种数据利用方式。他们在癌细胞系的WGBS数据中检出了多个已知融合事件，证明在适当条件下，同一份数据可以同时用于甲基化分析和已知融合基因检测。 为什么要找融合基因 融合基因（Fusion gene）是由两个不同基因的部分或全部序列连接形成的基因，属于结构变异的一种情况，其有可能是染色体易位、中间缺失或染色体倒置所致的结果。其中一些融合基因会产生功能异常的蛋白，推动肿瘤生长，也可能成为肿瘤分型和靶向治疗的重要依据。 BCR-ABL1就是一个经典例子。它由BCR和ABL1两个基因异常连接而成，是慢性髓性白血病的重要分子标志，也直接促成了相应靶向药物的应用。 目前，融合基因主要通过RNA测序、全基因组测序或靶向检测来寻找。但如果想从已有的甲基化数据中顺便找出融合基因，实际上还存在一定的挑战性。 经过转化的DNA更难找到断点 融合基因最关键的证据，是两个原本相隔很远的基因在某个位置连到了一起，这个连接位置通常被称为融合断点。而WGBS会经过亚硫酸氢盐处理，这一步会让DNA进一步碎裂，同时把未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，并在测序时被读成胸腺嘧啶。大量C变成T以后，序列之间的差异减少，比对难度再次增加。对于原本就跨越两个基因区域的读段，这些变化会进一步增加识别真实融合信号的难度。 这次研究团队没有在全基因组中寻找新融合，而是把分析范围缩小在已知的目标基因上。他们使用适用于亚硫酸氢盐测序数据、支持分段比对的工具，筛选融合相关读段。 研究人员重点寻找了两类能够支持基因融合的测序读段。一类是来自同一个DNA片段两端的成对读段，两条读段分别对应两个目标基因。虽然它们没有直接读到连接位置，但这种对应关系可以为两个基因发生融合提供间接支持。另一类读段直接跨过融合断点，读段一部分序列对应一个目标基因，另一部分对应另一个目标基因。这类读段可以帮助研究人员定位两个基因异常连接的位置。 先从BCR-ABL1开始 研究人员先分析了K562细胞。这个来源于慢性髓性白血病的细胞系携带明确的BCR-ABL1融合，很适合用来验证这次的方案合不合适。 结果显示，WGBS数据找到的BCR和ABL1断点位置，与全基因组测序得到的断点位置基本一致。两种数据在断点附近还出现了相似的测序覆盖度下降。更重要的是，研究人员在寻找融合的同时，仍然可以读取断点附近的DNA甲基化情况。 这一步说明，WGBS实验步骤中的亚硫酸氢盐转化虽然增加了分析难度，但数据中与已知融合有关的结构信息并没有完全消失。 样本里有多少融合阳性DNA才找得到 以上的实验还不够，因为真实样本很少像细胞系那样整齐。实际是，肿瘤细胞的DNA可能只占组织的一部分，尤其液体活检中的肿瘤DNA会更低。因此研究人员把K562细胞DNA逐级混入不含BCR-ABL1的NA12878 DNA中，融合阳性DNA所占比例从2%一直增加到100%，每个混合比例进行了3次重复。 在平均63倍测序深度下，融合阳性DNA占2%时，3次中有1次检出；占5%时，有2次检出；达到10%及以上时，各比例的3次重复均检出了融合信号。在这套实验条件下，研究人员根据阴性对照计算出的检出限为8.1%。 可以看到，这组数据给出了一个很清楚的边界。只有目标融合在样本中达到一定比例，并且测序深度足够时，WGBS才可以较稳定地找到它。而融合阳性DNA比例下降的话，漏检风险就会增加。 一份数据还能找到多个融合 验证完单个融合后，研究人员又分析了乳腺癌细胞系MCF-7。以往实验已经确认这个细胞系存在12个融合事件，这次的WGBS分析找到了其中10个，既包括同一条染色体内部的融合，也包括不同染色体之间的融合。 两次重复得到的融合支持读段数量高度一致，相关系数超过0.99。这说明结果具有较好的技术重复性，也表明WGBS数据有机会在一次分析中同时提供甲基化和多个已知融合的信息。 目前更适合做已知融合的定向分析 这项研究更像一次可行性验证，离常规临床检测还有一段距离。 首先，实验使用的是融合事件已经比较清楚的癌细胞系。患者肿瘤内部更加复杂，不同患者的融合断点也可能存在差异，细胞系中的表现不能直接等同于临床样本。 其次，全基因组范围内出现的假阳性融合读段很多。把范围限制在已知目标基因后，背景信号才得到较好控制。因此，这套方法当前更适合回答某个已知融合是否存在，还不适合直接承担全基因组新融合发现的任务。 检测灵敏度和成本也需要考虑。研究中的检出限为8.1%，平均测序深度达到63倍。这个水平对肿瘤含量较高的组织样本更有希望，用于循环肿瘤DNA比例常低于1%的液体活检仍显吃力，加大测序深度的话又会带来比较大的成本。 所以，这项工作没有改变RNA测序和全基因组测序在融合检测中的地位，它只是提供了另一种思路。当研究项目本来就需要WGBS，又恰好关注若干已知融合时，同一份数据或许可以被利用得更充分。 从一份数据里多读出一层信息 当研究项目本来就需要WGBS，又恰好关注若干已知融合时，就有机会通过进一步分析，从已有数据中获得额外的融合信息。 在这项研究中，研究人员使用聚焦超声把gDNA打断至约300bp，再进行末端修复、接头连接和后续转化。针对这类甲基化测序样本前处理需求，达远辰光提供一系列聚焦超声打断仪。本系列使用物理方式随机打断DNA，不依赖酶切识别位点，且DNA量损失少，稳定提供适合后续转化、文库构建和测序分析的DNA片段。 参考文献： [1] Kim T, Bang D. Detection of known gene fusions in cancer cell lines using whole-genome bisulfite sequencing data. Scientific Reports. 2026;16:13254. DOI: 10.1038/s41598-026-40803-0. [2] Liu SV, Nagasaka M, Atz J, Solca F, Müllauer L. Oncogenic gene fusions in cancer: from biology to therapy. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2025;10:111. DOI: 10.1038/s41392-025-02161-7. |
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