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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 双酶切酶连，如何才能获得好用的连接骨架？
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FreedomzzZ

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切酶连，如何才能获得好用的连接骨架？ 已有1人参与

各位大佬好，本人分子小白，现在遇到一些问题想请教一下大家。

大致情况：双酶切，酶切后的骨架约10000bp，条带约1400bp，比例约1：10计算。
在与同门同时进行操作，提质粒，酶切，胶回收，酶连，操作步骤基本相同，酶切前A260/280,A260/230数值都正常，双酶切电泳后的片段大小也正常，无杂带。但是最后的酶连转化效果天差地别，我的质粒连接效率很差，转化后长的克隆极少。我尝试了多次都是这样，而同门大概率成功，小概率失败。

于是我进行了比较实验，1.我的片段，我的骨架、2.我的片段，同门的骨架、3.同门的片段，我的骨架、4，同门的片段，同门的骨架。2，4组合的效果都不错，使用我的骨架都不怎么长克隆。

这究竟是为什么呢？如何获得好用的骨架载体呢？
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1楼 2026-09-07 11:07:11
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小莲子VIP

新虫 (初入文坛)
一些个人观点，供参考：
1. 酶切前做的A260/280,A260/230检测对你的连接体系没有参考意义，要参考胶回收后Nanodrop检测得到的DNA浓度和纯度数据；
2. 你多次尝试使用的是不是同一管胶回收得到的骨架样品？如果是那就没有办法确认是骨架本身序列的问题还是胶回收得到的骨架样品问题；
3. 假设是骨架的问题，确认一下选择的骨架是否是低拷贝质粒，如果是，可以考虑增加连接时各组分用量和转化时DNA和宿主菌用量
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2楼2026-09-21 10:06:17
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leister

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你的对比实验已经说明你的载体质粒可能本身有结构方面的问题。只要拿到了你的目的质粒就可以了，不必纠结在效率的高低上。质粒构建效率关键是感受态细菌的状态和连接的效率。
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3楼2026-10-07 13:58:14
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