| 查看: 75 | 回复: 0 | |||
[交流]
一步法RPA‑PfAgo新技术实现EB病毒快速高灵敏检测
|
|
EB病毒（Epstein‑Barr virus，EBV）是一种广泛传播的人类疱疹病毒，全球超过95%的成年人都曾发生过EB病毒感染。它不仅会引发传染性单核细胞增多症，更与鼻咽癌、淋巴瘤、EBV相关胃癌等多种恶性肿瘤密切相关。在临床中，EB病毒核酸载量检测是鼻咽癌早期筛查、疗效监测、预后评估的重要指标。 目前临床主流的EB病毒检测依靠荧光定量PCR（qPCR）。qPCR检测灵敏度高、结果可靠，但存在明显短板：需要专业核酸提取试剂盒完成样本核酸纯化、依赖精密热循环仪、检测周期长，整个流程通常需要2‑3小时；样本前处理步骤繁琐，对基层实验室、急诊快速筛查场景并不友好 。 面对临床对快速、简便、高灵敏病原检测的迫切需求，等温扩增技术与核酸酶识别系统成为分子诊断领域的研究热点。重组酶聚合酶扩增（RPA）可以在恒温条件下完成核酸扩增，不需要变温仪器；激烈火球菌Argonaute蛋白（PfAgo），来自Pyrococcus furiosus，凭借DNA引导的精准靶向剪切能力，能够实现靶标核酸的特异性信号输出，在病原检测领域展现出巨大潜力。 近期，苏州大学附属第三医院（常州市第一人民医院）检验科团队在SCI期刊《Microchemical Journal》发表研究，建立了无核酸提取、单管一步法RPA‑PfAgo检测体系，直接对原始样本完成EB病毒的快速灵敏检测，为EB病毒现场快速诊断提供全新技术方案 。 传统检测痛点：核酸提取成为快速检测的瓶颈 在传统核酸检测流程里，样本核酸提取是必不可少的一步。血液、细胞等临床样本中含有大量蛋白、抑制物，如果不经过裂解、纯化、洗脱，会抑制扩增酶活性，造成假阴性结果。但核酸提取操作步骤多、耗时，需要配套试剂盒与离心机，会拉长整体检测时间，限制了急诊、基层、现场筛查场景的应用。 RPA等温扩增技术，摆脱PCR的变温要求，37‑42℃恒温即可完成扩增，适合便携化检测。但单纯RPA扩增，特异性有限，容易出现非特异性扩增带来假阳性。而PfAgo蛋白，依靠向导DNA精准识别靶标序列，识别到目标序列后启动剪切，可将信号进一步放大，提升检测特异性与灵敏度，弥补单纯等温扩增的缺陷 。 但RPA扩增反应与PfAgo剪切反应，二者的反应条件并不完全兼容。以往很多研究需要分两步：先做RPA扩增，再把扩增产物转移到新管进行PfAgo检测。分管操作不仅增加操作步骤，还会带来气溶胶污染、样本交叉污染风险，也无法实现真正的“一步法”检测 。 本研究最大创新点，就是实现RPA扩增与PfAgo识别剪切在同一个反应管内完成，并且不需要提前做核酸提取，原始样本直接加入反应体系即可完成全部检测流程。 一步法RPA‑PfAgo体系：原理与技术亮点 该检测体系命名为Extraction‑free one‑pot RPA‑PfAgo assay，整套反应全部在单管内完成，分为两个核心过程： 1. RPA恒温扩增：样本加入反应管，不需要核酸纯化。体系内重组酶、单链结合蛋白、聚合酶协同作用，恒温条件下对EB病毒靶标DNA进行扩增，获得大量靶标片段。 2. PfAgo信号识别与输出：体系内预先加入向导DNA与PfAgo蛋白。当RPA扩增出EB病毒特异性靶序列后，向导DNA引导PfAgo识别靶标，激活剪切活性，切割荧光报告探针，释放荧光信号，实现结果读取。 整套体系实现两大突破： 第一，省去核酸提取步骤。直接使用未经纯化的临床原始样本，省去裂解、纯化、洗脱一系列操作，大幅缩短样本前处理时间，减少试剂耗材消耗。 第二，单管一步完成扩增‑识别‑信号读出，不用开盖转移产物，最大限度避免扩增产物气溶胶污染，降低假阳性风险，操作流程简单，对实验人员技术门槛更低 。 研究团队针对EB病毒保守基因设计特异性引物与向导DNA，对体系反应温度、反应时间、各组分浓度进行优化。实验结果表明：该体系在恒温条件下，整个检测可以在不到60分钟内完成，检测灵敏度高，能够识别极低拷贝数的EB病毒核酸；同时对其他常见病原体无交叉反应，具备优秀的特异性。 在模拟临床样本验证中，该无提取一步法体系，直接处理原始样本，检测结果和传统qPCR结果具备良好一致性。对于低病毒载量样本，该体系依然可以有效检出，满足临床筛查的灵敏度需求。 临床应用价值：面向急诊、基层、现场筛查 EB病毒检测的临床场景十分多元：鼻咽癌高危人群筛查、肿瘤患者治疗期间病毒载量动态监测、传染性单核细胞增多症的快速鉴别诊断。目前qPCR是金标准，但它不适合快速现场筛查。比如急诊门诊，需要快速区分EB病毒感染与其他病原体感染；基层医疗机构缺少高端分子实验室；大规模流行病学筛查，都迫切需要简便快速的检测手段。 这套RPA‑PfAgo一步法体系，具备明显优势： 1. 操作简化：无需核酸提取，原始样本直接上样；单管反应，不需要多次开盖移液，降低操作失误。 2. 设备门槛低：恒温孵育即可，不需要PCR仪，普通恒温金属浴就可以运行，未来有开发成便携检测设备的潜力。 3. 速度快：整体检测时间远短于qPCR，适合急诊快速出结果。 4. 污染风险低：闭管反应，扩增和信号检测在同一管完成，避免产物开盖造成的实验室气溶胶污染。 当然这项技术目前仍处于实验室研究阶段，距离大规模临床试剂盒落地还有一段距离。研究团队也指出，临床真实样本成分复杂，样本基质抑制物会对反应带来一定干扰，后续还需要进一步优化体系，提升复杂临床样本的耐受能力，开展更大样本量的临床样本验证。 一步法RPA‑PfAgo体系：原理与技术亮点 近年来，Argonaute蛋白（Ago）和CRISPR‑Cas系统，被称为两大核酸检测“明星工具”。CRISPR‑Cas系统依赖RNA向导，而PfAgo使用DNA向导，在反应条件、靶标兼容性上拥有独特优势，在病毒、细菌、基因突变检测领域快速发展 。 RPA‑PfAgo这种等温扩增+Ago蛋白识别的组合，把“扩增”和“特异性识别”结合在一起，是下一代快速分子诊断的重要方向。本次针对EB病毒建立的无提取一步法检测，不仅为EB病毒快速诊断提供新方案，也为其他病原体的快速检测提供了可借鉴的技术范式。 未来如果完成转化，有望应用于基层医院、急诊、体检筛查、现场快速检测，让病毒核酸检测不再高度依赖大型实验室设备。对于鼻咽癌高危人群，快速便捷的EB病毒检测，能够助力肿瘤早筛，更早发现疾病风险。 |
回复此楼» 猜你喜欢
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有60人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
-
ALK5 高选择性小分子 LY-3200882：可放大合成路线与质控要点解析
已经有0人回复
-
AM630（CAS 164178-33-0）：CB2 选择性配体的实验使用与供应要点
已经有0人回复
-
ADC标杆分子T-DM1全解析：从结构设计到实验室应用的技术要点
已经有0人回复
-
HILIC磁珠研究蛋白组学怎么做？
已经有0人回复
-
His标签蛋白纯化怎么才能快？
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
