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EM-seq兴起，DNA片段化仍需单独设计
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人体内形态各异、功能不同的细胞，共同构成了不同的组织和器官，但这些细胞最初都来自同一个受精卵。那么既然它们拥有基本相同的“底层代码”——DNA序列，为什么最终却产生了不同的细胞呢？一个重要原因在于，基因在不同细胞和发育阶段会被选择性地开启或关闭。这种选择性表达并非随机发生，而是受到多种机制的精细调控。其中，能够在不改变DNA碱基序列的情况下影响基因活动的调控机制，被统称为表观遗传调控。DNA甲基化，正是其中研究最广泛的一种机制。 在哺乳动物中，DNA甲基化主要是指在DNA甲基转移酶作用下，甲基被添加到胞嘧啶环的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。5mC还可在TET家族酶作用下进一步氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）。这种修饰主要发生在CpG位点。正常的甲基化模式参与胚胎发育、细胞分化、基因组印记、X染色体失活以及基因组稳定性的维持；异常甲基化则与肿瘤等多种疾病的发生发展有关。因此，要理解DNA甲基化的生物学作用，不仅需要了解样本整体的甲基化水平，还需要进一步确定甲基化发生在基因组的哪些区域，以及这些区域的甲基化程度发生了怎样的变化。 为了定位这些变化，研究人员发展出多种能够以单碱基分辨率绘制甲基化图谱的测序方法。其中，全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）被广泛应用。在WGBS中，未甲基化的胞嘧啶经过亚硫酸氢盐处理后转化为尿嘧啶，并在测序中被读取为胸腺嘧啶；5mC和5hmC则通常保留为胞嘧啶信号，研究人员由此判断不同位点的甲基化状态。不过，这种化学转换过程也会对DNA本身造成影响。 转换带来的损伤 亚硫酸氢盐转换通常需要较为强烈的化学反应条件，处理过程中可能加剧DNA降解，造成DNA链断裂和模板损失。这些损伤不仅会使DNA片段进一步缩短，还可能影响文库产量和复杂度，增加测序重复率升高或基因组覆盖不均的风险。 对于起始量较低、DNA质量有限或难以重复获取的样本，这类模板损失带来的影响更加明显。所以在如何获得单碱基分辨率甲基化信息的同时，尽量减少转换过程对DNA的损伤，也成为甲基化测序方法改进的重要方向。 从化学到酶促 为了减少亚硫酸氢盐转换造成的DNA损伤，研究人员开发了酶促甲基化测序（Enzymatic Methyl-seq，EM-seq）。这是一种利用酶促反应替代亚硫酸氢盐处理，区分修饰与未修饰胞嘧啶的甲基化测序方法。它与WGBS的检测目的相似，都可以获得单碱基分辨率的甲基化信息，但两者完成胞嘧啶转换的方式不同。 EM-seq通过两步酶促反应完成转换。首先，TET2和T4-BGT通过氧化和糖基化作用保护5mC与5hmC；随后，APOBEC将未修饰的胞嘧啶脱氨为尿嘧啶。经过扩增和测序后，未修饰的胞嘧啶被读取为胸腺嘧啶，受到保护的5mC和5hmC则保留为胞嘧啶信号。需要注意的是，标准EM-seq会将5mC和5hmC共同保留为胞嘧啶信号，因此通常得到的是两者的合并信息，并不能直接区分5mC与5hmC。 由于避开了亚硫酸氢盐的强烈化学处理，EM-seq可以减少转换过程中的DNA降解和模板损失。2025年发表于《Clinical Epigenetics》的一项比较研究发现，酶促转换与亚硫酸氢盐转换获得的甲基化结果具有较高一致性；在该研究采用的样本和实验流程中，酶促转换还表现出更少的DNA片段化、更高的文库产量和更多的unique reads。 不过，转换条件更加温和，并不意味着EM-seq能够消除甲基化测序中的所有偏差。起始样本质量、文库扩增、测序深度和数据分析方法等因素，仍可能影响最终获得的甲基化结果。 “酶法”不等于酶切 需要注意的是，EM-seq中的“酶促”指胞嘧啶转换，并不等同于使用酶完成DNA片段化，也未改变短读长文库对DNA片段分布的要求。因此，以完整基因组DNA为起始材料的EM-seq实验，仍需按照建库试剂和测序平台的要求获得合适的片段分布，再进行末端修复、接头连接、酶促转换和文库扩增等步骤。 对于采用物理超声片段化的EM-seq流程，达远辰光非接触式聚焦超声设备可满足单样本及多样本并行处理需求，并支持对声学能量、处理时间等参数进行调节。实验人员可根据样本状态、目标片段范围和建库要求优化处理条件，使获得的片段化DNA样本更好地满足后续建库和测序要求。 参考文献： [1] Vaisvila R, Ponnaluri VKC, Sun Z, et al. Enzymatic methyl sequencing detects DNA methylation at single-base resolution from picograms of DNA. Genome Research. 2021;31(7):1280–1289. DOI: 10.1101/gr.266551.120. [2] Nuttall B, Karl DL, Burke K, et al. Comprehensive comparison of enzymatic and bisulfite DNA methylation analysis in clinically relevant samples. Clinical Epigenetics. 2025;17:156. DOI: 10.1186/s13148-025-01959-0. [3] Olova NN, Andrews S. Whole Genome Methylation Sequencing via Enzymatic Conversion (EM-seq): Protocol, Data Processing, and Analysis. Methods in Molecular Biology. 2025;2866:73–98. DOI: 10.1007/978-1-0716-4192-7_5. CRISPR off-targets. Nat Genet. 2026;58:20–27. DOI: 10.1038/s41588-025-02428-3 |
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