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[求助]
蛋白纯化求助
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我现在正在研究毕节假单胞菌2P24?的基因组中Tc毒素，Tc toxin是一类由某些细菌产生的毒性蛋白复合物，主要功能是帮助细菌感染并杀死昆虫宿主，广泛存在于昆虫和人类病原体中的一类大型三组分（TcA, TcB, TcC）ABC型毒素毒素。TcB 和 TcC 形成，共同形成一个 “茧” 状结构，包裹着 TcC 的 C 末端高变区（HVR，它在不同细菌来源的Tc毒素中，其氨基酸序列、长度和组成结构均呈现出极高的多样性，这种多样性是Tc毒素功能适应性和进化灵活性的核心体现。），该区域被自身蛋白水解裂解并位于茧内。HVR代表实际的货物，这是一个高度有效的和非选择性的细胞毒效应。TcA与TcB-TcC结合，并伴随构象变化，产生完全组装且具有活性的全毒素。全毒结合靶细胞表面受体并进行内吞作用。pH值的变化触发TcA外壳的打开，并将毒素像注射器一样转移到靶标中。然后毒素破坏细胞过程，导致细胞死亡。 而我主攻tc toxin的hvr部分，整体研究计划是把hvr这个蛋白纯化出来，观察其特定结构或者对这蛋白进行酶活以及pull down分析，最后想通过纯化出的hvr蛋白做真核系统验证（对昆虫细胞做毒性实验）。因此我的研究目的是分析toxin中hvr的分子作用机制，以及具体的作用靶点。 所以实验研究中我先是对运用pet28a载体对hvr基因进行了构建，在hvr的N端带上了his标签（因为经过结构预测hvr的c端被包裹在其tcb与tcc茧状结构内部不容易做镍柱亲和层析实验）经过测序正确后获得重组质粒将其转入bl21菌株中。后面就是对该重组菌株进行纯化，由于经过破碎离心后通过sds-page显示发现我的蛋白是包涵体，对此我进行了优化条件。先是用含有促溶标签的sumo或者pgex来构建重组质粒，发现蛋白仍是包涵体；后面通过降低时间或iptg浓度至终浓度为0.01mM仍是包涵体。 后面我就从包涵体中获得高纯度的可溶性活性蛋白。针对8M尿素变性的蛋白，我们依据文献调研，锁定了三种主流的复性路径：① 直接稀释透析、② 柱上梯度复性、③ 精氨酸辅助稀释复性。 首先尝试了最经典的一步稀释透析法：将变性蛋白直接稀释后装入透析袋，对基础缓冲液透析过夜。结果显示，蛋白在透析过程中发生了剧烈的不可逆聚集，上清中几乎回收不到目标蛋白。 为防止分子间聚集，又尝试了柱上梯度复性，利用镍柱的物理锚定让蛋白在缓慢降低的尿素环境中独立折叠。然而，SDS-PAGE结果显示，随着尿素浓度从6M降至0M，流穿液中出现了蛋白条带。说明该蛋白在正确折叠的同时，其His标签可能被折叠进了蛋白内部，导致与镍柱的结合力大幅减弱，蛋白在复性过程中被‘主动吐出’了。既然该蛋白在柱上‘留不住’，柱上复性路线被正式排除，我们转向溶液复性。 基于上述排除结果，转用精氨酸辅助稀释复性。我将5ml变性蛋白缓慢稀释至75ml含1M精氨酸的复性液中（终尿素<0.6M）。结果发现精氨酸成功抑制了聚集，稀释液在离心后上清清澈，SDS-PAGE显示大量可溶性蛋白存在。然而，问题出现在下一步：透析去除精氨酸时。当我们用不含精氨酸的基础缓冲液进行透析以去除精氨酸时，蛋白再次出现肉眼可见的絮状聚集。这说明：精氨酸确实是防止聚集的关键，但‘快速去除精氨酸’的过程本身，对蛋白构成了第二次‘冲击’（渗透压突变和疏水保护丧失）。 因此针对我包涵体的变复性实验研究，我下步该如何优化包涵体变复性实验，把hvr蛋白纯化出来？ @biostar2009 @飞约疯人院 @youlinglyw 发自小木虫手机客户端 |
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