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从首个个体化CRISPR疗法说起：基因编辑的脱靶风险如何被发现？
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2025年，一项发表于《新英格兰医学杂志》的病例引起广泛关注：一名患有严重氨甲酰磷酸合成酶1缺乏症（CPS1 deficiency）的婴儿，接受了为其突变位点专门设计的腺嘌呤碱基编辑治疗。 研究团队将碱基编辑系统装入脂质纳米颗粒，患儿先后接受了两次输注。截至论文报告时，患儿已经能够摄入更多膳食蛋白，氮清除药物用量有所下降，且未观察到不可接受或严重的不良事件。不过，研究人员强调，这只是早期结果，疗效持续时间与长期安全性仍需继续观察。[1] 这项研究让“为单个患者定制基因编辑药物”的设想开始走向临床。但是，对于一项直接改写基因组的治疗而言，短期内未出现严重不良事件，并不等于分子层面的风险已经完全排除。尤其是这种为单个患者量身定制的编辑器，其靶点和向导RNA都具有高度个体化特征，已有药物的安全性数据无法直接套用。因此，研究人员除了确认目标突变是否得到有效纠正，还必须结合患者的基因组信息，排查编辑器是否在其他位置产生了非预期改变。这也是CRISPR真正进入人体后更需要回答的问题。 当编辑发生在预定靶点之外 这种在除了预定靶点之外，还可能在基因组的其他位置产生了非预期改变的编辑，被称为脱靶效应。由于不同编辑工具改写DNA的方式不同，脱靶的发生机制和表现形式也有所区别。 经典CRISPR-Cas9系统依靠向导RNA识别目标序列，再由Cas9核酸酶切断DNA。如果基因组中存在与目标位点相似的序列，Cas9也可能在那里结合并造成双链断裂，随后在DNA修复过程中形成插入、缺失，甚至更复杂的结构变异。 碱基编辑器的情况有所不同。它通常由Cas9切口酶与脱氨酶组成，可以在不产生典型DNA双链断裂的情况下完成单碱基转换。但这并不意味着脱靶风险消失了。碱基编辑器仍可能在预定靶点之外的其他位置引起非预期碱基转换。 无论是Cas9核酸酶造成的非预期切割，还是碱基编辑器引起的非预期碱基转换，这些变化都可能散布在庞大的基因组中。要评价其潜在风险，还需要解决的问题是： 如何从数十亿个碱基中找到可能发生脱靶的位置？ 仅凭根据向导RNA与基因组序列的相似程度进行软件预测出的候选位点名单，是否足以覆盖真正的脱靶风险？ 不能只靠软件预测 脱靶分析通常会从计算预测开始。算法会根据向导RNA序列、PAM类型、错配数量和位置等信息，在参考基因组中寻找相似位点。这种方式快速、成本较低，也适合形成初步候选名单。 但软件只能发现“已经想到的相似序列”。一些错配较多、包含插入或缺失，或者受个体遗传变异影响的位点，可能不会出现在预测结果中。对于接受个体化治疗的患者而言，参考基因组也无法完全代表其真实基因组。 因此，软件预测更适合作为脱靶分析的起点，而不能单独构成安全性结论。为了发现候选名单之外的潜在位点，研究人员进一步开发了多种实验性全基因组检测方法。其中一类方法是将提取出的基因组DNA直接暴露于编辑工具，再通过测序捕捉DNA上留下的反应信号，从而在不预先限定具体位置的情况下寻找潜在脱靶位点。Digenome-seq便是较早建立的代表性方法之一。 Digenome-seq：从全基因组中寻找异常切口 Digenome-seq的基本思路是，将提取出的基因组DNA与Cas9及向导RNA在体外进行反应，随后做全基因组测序。[2] 如果某个位点被Cas9切开，大量测序片段就会在相同位置出现整齐排列的起始或终止端。通过分析这些异常集中的片段末端，便可以识别候选切割位点。 这种方法能够扩大脱靶位点的搜索范围，但并不会专门富集被Cas9切开的DNA分子。潜在脱靶信号需要从大量未发生切割的背景序列中识别，因此通常需要较高的测序深度。对于碱基编辑器，由于其产生的主要是碱基转换而非DNA双链断裂，所以还需要借助相应的DNA处理酶，将特定碱基变化转化为可以被测序识别的断端。 在部分Digenome-seq及其碱基编辑版本中，经过体外编辑和酶处理的DNA还需要通过超声打断制备成适合全基因组测序的片段。需要注意的是，这一步只是为后续建库获得合适的DNA片段。真正用于判断脱靶活动的信号，仍来自编辑器或后续处理酶产生的特异性末端。 CIRCLE-seq：先把DNA做成环，再寻找被切开的分子 CIRCLE-seq是另外一种实验性全基因组检测方法。它的思路是，实验首先通过物理超声将长片段基因组DNA随机片段化，打断后的平均片段长度约为300 bp，随后进行末端修复、接头连接和环化，未成功成环的线性DNA被去除，只保留环状DNA文库。[3] 这些环状DNA经过Cas9-向导RNA复合物处理后，如果某个DNA环中包含能够被Cas9识别的目标位点或潜在脱靶位点，那么DNA环便会被切开并重新变为线性分子。实验再针对这些新形成的断端连接测序接头进行扩增和测序。 与从全部基因组序列中寻找异常断端相比，CIRCLE-seq能够对切割产物进行富集，减少大量背景DNA带来的测序负担。不过，该方法需要先建立质量稳定的环状DNA文库，因此物理超声产生的片段长度及其分布，会影响后续末端修复、DNA环化和文库复杂度。 编辑工具升级，检测方法也要升级 2020年发表的CHANGE-seq沿用了环状DNA文库和切割产物富集的基本思路，不同的是，它是利用Tn5转座酶完成的DNA片段化和接头引入。[4] 到了2026年，研究人员又发表了面向碱基编辑器的CHANGE-seq-BE。该方法先在体外让碱基编辑器作用于环状基因组DNA，再利用Endonuclease V或USER等酶识别并处理编辑产生的碱基变化，将其转换为可富集、可测序的分子末端。[5] 在HBB靶点的研究中，CHANGE-seq-BE不仅检出了此前已经确认的54个细胞脱靶位点，还发现了29个此前未知、随后在细胞中得到验证的脱靶位点。与最初采用Cas9核酸酶开展的CIRCLE-seq筛查相比，检出的真实细胞脱靶位点增加了53%。在针对多个治疗相关靶点的比较中，与Digenome-seq相比，该方法以约二十分之一的测序读数获得了更高的检测敏感性。 这一结果说明，不能简单地用Cas9核酸酶的脱靶谱代替碱基编辑器的脱靶谱。当编辑工具发生变化时，相应的风险检测方法也需要重新设计。 还需要回到细胞中验证 Digenome-seq、CIRCLE-seq和CHANGE-seq-BE等方法扩大了脱靶位点的搜索范围，但主要还是以提取的基因组DNA为对象进行实验。其实离开细胞之后，DNA不再保持原有的染色质结构，也无法反映编辑工具在不同细胞中的递送效率、作用时间和DNA修复过程。 因此，体外检测发现的位点代表“可能发生编辑的位置”，并不意味着这些变化一定会在实际治疗的细胞或组织中出现。研究人员还需要回到相关细胞中，对候选位点进行靶向深度测序，确认非预期编辑是否真实发生，并测量其频率。 在个体化基因编辑治疗水平上，还需要考虑患者自身的遗传变异。患者基因组中的单核苷酸变异或小片段插入、缺失，可能产生参考基因组中不存在的新相似位点。因此，个体化脱靶评价还应结合患者的实际基因组序列，并在相关细胞中验证候选位点。 安全性不是一张“零脱靶”证明 脱靶检测的终点，并不是得到一张候选位点清单，而是判断其中哪些变化可能转化为实际风险。即使检测到非预期编辑，也需要结合其发生频率、所在的基因组区域、受影响的细胞类型以及可能产生的功能后果进行解释。 发表于《自然·遗传学》的一篇观点文章也指出，简单追求“接近零脱靶”并不足以完成临床风险评价。[6] 位于基因间区的极低频变化，与发生在原癌基因、抑癌基因或关键调控区域的变化，其风险显然不能等量齐观。脱靶评价最终需要回到治疗获益与潜在风险的平衡。 针对CIRCLE-seq及部分Digenome-seq流程这种需要物理超声片段化的应用，达远辰光BoFU系列聚焦超声打断仪可用于基因组DNA样本前处理，并可根据DNA投入量、样本体积和目标片段区间建立相应的处理参数，为后续建库和测序提供稳定、可重复的DNA片段化样本。 参考文献： [1] Musunuru K, et al. Patient-Specific In Vivo Gene Editing to Treat a Rare Genetic Disease. N Engl J Med. 2025;392:2235–2243. DOI: 10.1056/NEJMoa2504747 [2] Kim D, et al. Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells. Nat Methods. 2015;12:237–243. DOI: 10.1038/nmeth.3284 [3] Tsai SQ, et al. CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR–Cas9 nuclease off-targets. Nat Methods. 2017;14:607–614. DOI: 10.1038/nmeth.4278 [4] Lazzarotto CR, et al. CHANGE-seq reveals genetic and epigenetic effects on CRISPR–Cas9 genome-wide activity. Nat Biotechnol. 2020;38:1317–1327. DOI: 10.1038/s41587-020-0555-7 [5] Lazzarotto CR, et al. Sensitive and unbiased genome-wide profiling of base-editor-induced off-target activity using CHANGE-seq-BE. Nat Biotechnol. 2026. DOI: 10.1038/s41587-025-02948-7 [6] Angelini Stewart A, et al. Measurement and clinical interpretation of CRISPR off-targets. Nat Genet. 2026;58:20–27. DOI: 10.1038/s41588-025-02428-3 |
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