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科研战神来了新虫 (小有名气)
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[交流]
WB条带被质疑了，原因是我没有做阴性对照！
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在蛋白检测中WB实验一直被视为金标准，但是经常在实验遇到让人最崩溃的瞬间就是出现阴性条带。原本阴性条带(NC)理论上是干干净净的，一旦出现条带，对于整个实验而言，其可信度就是大打折扣的。那为什么出现这样的情况呢？ 在这之前，我们先了解什么是WB阴性对照？为什么它必须没有条带？阴性对照(Negative Control)是WB实验设计中最基础也最关键的对照之一，它的核心作用只有一个，那就是证明你的阳性信号是"真的"，而不是"假的"。 那什么情况下，会出现阴性对照呢？凡是想证明条带因自己处理而出现的，就必须有阴性对照来回答没有处理时是否会出现，所以说阴性对照不是可选项，而是WB数据可信度的底线。那些实验必须做阴性对照呢？ (1) 在过表达实验中，转染空载体的细胞可排除内源性蛋白干扰； (2) 基因敲除/敲低时，野生型或scramble对照能验证敲除特异性，药物或诱导处理需搭配溶剂对照(如DMSO)，排除试剂本身影响； (3) CO-IP验证蛋白互作必须用正常IgG替代特异性一抗，排除beads或抗体非特异性结合； (4) 磷酸化/修饰检测需未刺激细胞对照，确认信号源于修饰诱导； (5) 组织样本检测则要用已知阴性组织验证抗体特异性。那如果出现阴性条带，如何排查？ 空白泳道有条带?试剂/耗材污染全部换新重做 不加一抗有条带? 二抗非特异性结合 降二抗浓度/换交叉吸附二抗 空载体有条带但较浅? 内源性表达 换未转染细胞/查文献 CO-IP的lgG对照有条带? 抗体轻重链/洗涤问题换种属/加强洗涤 以上都不是?一抗特异性问题 做阻断实验/换单克隆抗体 |
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