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科研战神来了新虫 (小有名气)
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[交流]
提 RNA 不出错！纯 RNA 提取完整步骤 & 实用小技巧
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一、实验前准备桌面清洁： 用 RNase 清除喷雾擦拭台面及移液器，必要时在通风橱内操作。试剂配制：75% 乙醇：无水乙醇 : 无酶水 = 3 : 1（现配现用，冰浴预冷）。氯仿、异丙醇：开封后密封避光保存。样品准备（根据样品类型选择）： 二、RNA 提取步骤1. 裂解与匀浆加入 1 mL Trizol 后，用枪头反复吹打至无明显细胞团块，室温静置裂解 10 min。将裂解液转移至 1.5 mL 无核酸酶 EP 管（组织匀浆可直接离心取上清后转移）。2. 氯仿抽提（分离 RNA）按 Trizol : 氯仿 = 5 : 1 比例，加入 200 μL 氯仿。用手大力震荡 15 s（禁止涡旋振荡，以免打断 RNA 或造成 DNA 污染），充分混匀至乳白色。 室温静置 2–3 min，使核蛋白复合物完全解离。 3. 离心分层4℃, 12,000×g 离心 20 min。离心后可见三层：上层：无色水相（含 RNA）中层：白色絮状（DNA 和蛋白）下层：粉红色有机相（蛋白、酚等） 4. 吸取水相小心吸取 400 μL 上层水相（推荐用 200 μL 枪头分两次取，枪尖随液面下移而缓慢下移，避免吸到中间层）。关键：宁少勿多，若吸到蛋白层会导致 RNA 污染。 5. RNA 沉淀加入 600 μL 异丙醇（水相:异丙醇 ≈ 1:1.5），上下颠倒混匀约 10 次。室温静置 10 min（时间不宜过长，以防盐类共沉淀）。4℃, 12,000×g 离心 10 min，离心后管壁底部可见白色胶状 RNA 沉淀。 6. 洗涤 RNA（两次乙醇洗涤）弃上清（直接倒掉或小心吸出）。加入 1 mL 预冷的 75% 乙醇，轻轻颠倒使沉淀飘起（无需吹打）。4℃, 7,500×g 离心 5 min，弃上清。重复上述洗涤一次。小技巧：弃上清后，再次短暂离心（4℃, 7,500×g, 1 min），用 黄枪头套白枪头 吸尽管底残留的乙醇。保持管壁干净，避免沉淀变干。7. 晾干沉淀打开管盖，室温晾干 2–10 min（沉淀少则 2–3 min，多则 5–10 min）。观察沉淀由白色变为 半透明状 即可。注意：过度干燥会导致 RNA 难溶；未晾干则残留乙醇影响后续反应。8. 溶解 RNA根据沉淀量加入 20–60 μL 无核酸酶水（或 0.1% DEPC 水）。室温放置 1–2 min，用枪头轻轻吹打溶解。立即用于下游实验或分装后 -80℃ 保存。   |
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