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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » pcr 扩增问题
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] pcr 扩增问题

pcr 扩增问题

以下是我让我头痛的问题，咱是个新手，望各位指教，谢谢！
问题1. 我是提取感病植物总RNA，用RT-PCR扩增病毒全长序列——约10kb，第一次提取的RNA能扩出全长，可最近几次提的RNA，用相同的方法再也扩不出来了。
问题2. 我分别用第一次扩得全长的PCR产物和胶回收产物都不能扩得全长
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1楼 2009-11-16 11:02:09
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微毛虫

金虫 (小有名气)
★ ★
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1949stone(金币+1,VIP+0):降解后还可以扩出来么? 11-16 17:41
RNA很容易降解的，你看看是不是降解了~
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踮起脚尖才能更接近阳光
2楼2009-11-16 12:31:00
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自强8638

铜虫 (初入文坛)
★
1949stone(金币+1,VIP+0):有可能 11-16 17:40
可能杂质太多了，影响了酶的活性吧，要不再提纯一下试试。
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biotechnology
3楼2009-11-16 12:48:39
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)
谢谢各位仁兄，我们第一次用Trizol提的RNA确实不好  有降解  但能P出来,可后面提得RNA感觉要比第一次的好  可就是扩不出全长  扩几K的小片段还是没问题的。
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4楼2009-11-16 13:23:34
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huangfaping

银虫 (小有名气)
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1949stone(金币+5,VIP+0):鼓励新朋友 以后多多发帖啊 11-16 17:39
用第一次扩得全长的PCR产物和胶回收产物都不能扩得全长，是不是该考虑第一次或许扩增的并不是目的片段，有可能吗？
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5楼2009-11-16 13:31:30
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qqsvery

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
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1949stone(金币+2,VIP+0):谢谢交流 11-16 17:40
你提取出来后放了多久？怕是污染了！知道吗？如果原液中有一丁点RNA酶的话，在pcr的时候就会发挥巨大的作用：把你的RNA降解掉！
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谎言和真实在河边洗澡，谎言先洗好，穿走了真实的衣服，真实却不肯穿谎言的衣服。后来人们眼里只有穿着真实衣服的谎言，却很难接受赤裸裸的真实。
6楼2009-11-16 13:34:39
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竹子2225

银虫 (小有名气)
★
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是不是你的东西中有RNA酶，肯能对你的目的产物有影响的，你得去除才可以...
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7楼2009-11-16 13:45:08
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by huangfaping at 2009-11-16 13:31:
用第一次扩得全长的PCR产物和胶回收产物都不能扩得全长，是不是该考虑第一次或许扩增的并不是目的片段，有可能吗？

我每次都是提完RNA马上就做反转录的，降解的因素影响应该不是很大。
关键是我用第一次的PCR产物为模板做第二次PCR的时候扩不出来，我觉得应该是优化反应体系和条件的问题？
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8楼2009-11-16 15:50:15
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hyde0706

木虫 (正式写手)
★ ★
1949stone(金币+2,VIP+0):也许是 11-16 17:42
第二次PCR的时候你的第一次PCR产物稀释了多少倍？模板大多也是对扩增有抑制的。
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9楼2009-11-16 15:57:28
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by hyde0706 at 2009-11-16 15:57:
第二次PCR的时候你的第一次PCR产物稀释了多少倍？模板大多也是对扩增有抑制的。

我做过胶回收产物稀释1倍、10倍、20倍和50倍的  由于是大片段胶回收的效率也不高  跑胶条带段很淡，大概7-8ng/ul。但也没扩出来过
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10楼2009-11-16 16:33:27
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