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plantst5928

铜虫 (小有名气)

[交流] 扩PCR的问题

最近在做构建,难免要扩菌液PCR来验证阳性菌,我的习惯是在扩pcr的时候加一个阴性对照,也就是空白对照,里面只有pcr的预混,没有菌液模板,但是最近的结果很是令人苦恼,每次扩pcr的时候,阴性对照总是能扩出条带来,而且和阳性菌的目的带是一个大小,我换了好几个模板,用的是各自的引物,但是结果总是这样,阴性对照的上样道总是有目的带。但是有时候把扩的有阳性带的菌摇起来提质粒后却发现这个是假阳性。搞的我工作做了很多,都是白做。我已经排除了taq酶,buffer,水(换新的)和引物(换用质粒模板正常)的污染了。我每次都是把预混配好,然后分装到各管。最后加菌液模板。现在很头疼到底是哪里出了问题
哪位大侠能帮忙分析一下??
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ychh521

木虫 (小有名气)

换电泳液,枪头灭菌,
9楼2009-11-16 16:13:18
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j2

木虫 (正式写手)

★ ★
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1949stone(金币+1,VIP+0):谢谢交流 11-16 09:53
但是有时候把扩的有阳性带的菌摇起来提质粒后却发现这个是假阳性。
没太懂
电泳的时候没有阳性溢到阴性空里面吧~
修炼ing,当虫仙……
2楼2009-11-16 09:12:38
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fykxy_206

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1949stone(金币+2,VIP+0):有道理 11-16 09:53
这个最大的问题就在你的电泳槽里的电泳液了。是不是很久没有换了?下次换下电泳液,加样的时候可以在外面加好样再小心的放进电泳槽里面。总之不要溢出来。这样的话就应该没有问题了。

再有就是你的PCR管是不是带有污染的?用手碰过吗?加样是在无菌操作间进行的吗?
3楼2009-11-16 09:41:48
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heismeng

金虫 (小有名气)

这个 我都不用阴性对照的
colony pcr有时候不准 不行你就酶切吧
然后如果还是没有阳性菌的话 就再连一次
连之前检查一下vector 我上次做的时候vector别人给的 根本就不对
5楼2009-11-16 10:14:53
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