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melodyxin

铜虫 (小有名气)

[交流] 基因组DNA进行PCR的一个问题

前阵子做真菌的转化实验,拿到转化子以后液体培养、提总DNA、PCR目的片段进行验证。

结果问题来了:20ul的PCR体系,分别加0.5ul、1ul、1.5ul模板,只有0.5ul的PCR体系得到了目的片段。

这是为什么呢?是不是可以认为这是阳性转化子?
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)


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引用回帖:
Originally posted by melodyxin at 2009-11-15 22:26:
前阵子做真菌的转化实验,拿到转化子以后液体培养、提总DNA、PCR目的片段进行验证。

结果问题来了:20ul的PCR体系,分别加0.5ul、1ul、1.5ul模板,只有0.5ul的PCR体系得到了目的片段。

这是为什么呢?是不是 ...

有没有阴性对照呢?如果阴性对照也没有的话就可以认为是阳性转化子了。因为有的时候模板浓度过高会导致PCR P不出来的。
2楼2009-11-16 00:01:34
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xiaozi2964

金虫 (正式写手)


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可以把PCR体系做大点,做到25微升或50可能好些吧,阴性对照要做才有说服力啊!!
3楼2009-11-16 09:32:43
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huangfaping

银虫 (小有名气)

模板浓度高会导致pcr不出来的,可以看看0.5ul以下的能不能出来
4楼2009-11-16 13:46:57
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qqsvery

木虫 (著名写手)

你制板后的终浓度是多少?我们一般是加2微升。
谎言和真实在河边洗澡,谎言先洗好,穿走了真实的衣服,真实却不肯穿谎言的衣服。后来人们眼里只有穿着真实衣服的谎言,却很难接受赤裸裸的真实。
5楼2009-11-16 14:05:21
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hyde0706

木虫 (正式写手)


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模板最好能够测紫外大概定个量。模板多了会抑制扩增,不过不至于完全扩不出来吧?建议增加阳性和阴性对照。
6楼2009-11-16 15:52:30
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linjohnsky


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模板浓度太高会抑制PCR扩增,最好还是做做阴性对早比较有说服力!!
7楼2009-11-16 19:41:20
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melodyxin

铜虫 (小有名气)

我做了阴性对照的,阴性的p出来的大小和阳性的不一致的。
8楼2009-11-17 20:06:33
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melodyxin

铜虫 (小有名气)

我感觉自己的模板浓度也不是太高啊,上样2ul跑电泳,亮度一般的说。
9楼2009-11-17 20:07:15
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