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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 基因组DNA进行PCR的一个问题
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melodyxin

铜虫 (小有名气)

[交流] 基因组DNA进行PCR的一个问题

前阵子做真菌的转化实验，拿到转化子以后液体培养、提总DNA、PCR目的片段进行验证。

结果问题来了：20ul的PCR体系，分别加0.5ul、1ul、1.5ul模板，只有0.5ul的PCR体系得到了目的片段。

这是为什么呢？是不是可以认为这是阳性转化子？
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1楼 2009-11-15 22:26:10
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by melodyxin at 2009-11-15 22:26:
前阵子做真菌的转化实验，拿到转化子以后液体培养、提总DNA、PCR目的片段进行验证。

结果问题来了：20ul的PCR体系，分别加0.5ul、1ul、1.5ul模板，只有0.5ul的PCR体系得到了目的片段。

这是为什么呢？是不是 ...

有没有阴性对照呢？如果阴性对照也没有的话就可以认为是阳性转化子了。因为有的时候模板浓度过高会导致PCR P不出来的。
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2楼2009-11-16 00:01:34
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xiaozi2964

金虫 (正式写手)
★
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可以把PCR体系做大点，做到25微升或50可能好些吧，阴性对照要做才有说服力啊！！
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3楼2009-11-16 09:32:43
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huangfaping

银虫 (小有名气)
模板浓度高会导致pcr不出来的，可以看看0.5ul以下的能不能出来
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4楼2009-11-16 13:46:57
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qqsvery

木虫 (著名写手)
你制板后的终浓度是多少？我们一般是加2微升。
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谎言和真实在河边洗澡，谎言先洗好，穿走了真实的衣服，真实却不肯穿谎言的衣服。后来人们眼里只有穿着真实衣服的谎言，却很难接受赤裸裸的真实。
5楼2009-11-16 14:05:21
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hyde0706

木虫 (正式写手)
★
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模板最好能够测紫外大概定个量。模板多了会抑制扩增，不过不至于完全扩不出来吧？建议增加阳性和阴性对照。
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6楼2009-11-16 15:52:30
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linjohnsky

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
模板浓度太高会抑制PCR扩增，最好还是做做阴性对早比较有说服力！！
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7楼2009-11-16 19:41:20
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melodyxin

铜虫 (小有名气)
我做了阴性对照的，阴性的p出来的大小和阳性的不一致的。
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8楼2009-11-17 20:06:33
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melodyxin

铜虫 (小有名气)
我感觉自己的模板浓度也不是太高啊，上样2ul跑电泳，亮度一般的说。
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9楼2009-11-17 20:07:15
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