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无学论hh

新虫 (初入文坛)

[求助] 纯化,异源表达 已有1人参与

我是做酶的,我在异源表达好后,培养破碎得到粗酶液,检测有活性,但是在做镍柱纯化时,感觉蛋白不挂柱子,我是在蛋白质双端都加上了6xhis标签,求大神们,帮忙解答一下,该怎么做。
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隐约

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
跑蛋白胶,检测酶活;先确定酶在上清还是沉淀里面,然后验证酶是不是不挂柱子,
2楼2026-01-20 13:57:09
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无学论hh

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 隐约 at 2026-01-20 13:57:09
跑蛋白胶,检测酶活;先确定酶在上清还是沉淀里面,然后验证酶是不是不挂柱子,

谢谢,这个是可溶性蛋白,我每次都是破碎得到粗酶液,然后12000rpm离心20min后去检测上清液的酶活的,有酶活后再去做的纯化,纯化时反复用粗酶液过柱子3-4遍,然后先用40mM的咪唑溶液洗去杂蛋白,100-500mM咪唑溶液探究目的蛋白洗脱浓度,用蛋白质定量试剂G250实时检测洗脱液中蛋白浓度,但是做了几次都是40mM就洗出来了大部分蛋白,然后100mM洗出一点,200-500逐渐减少了,每个浓度洗脱液都用了四杯柱,用底物检测酶活时,过柱子剩下的粗酶液中酶活最高,40mM咪唑溶液中酶活较高,100-500与前者比断档级降低。
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3楼2026-01-20 16:23:00
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无学论hh

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 隐约 at 2026-01-20 13:57:09
跑蛋白胶,检测酶活;先确定酶在上清还是沉淀里面,然后验证酶是不是不挂柱子,

蛋白胶我正在做,等出来再看看结果,其实有人推荐我用MBP大标签,但是这个标签可能会影响酶的空间结构进而影响酶活,最主要的是这个表签需要切除,酶切反应要过夜,所以无法第一时间进行实验,一直在考虑要不要用,想问一下大家还有没有什么好的方法。
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4楼2026-01-20 16:26:54
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