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纯化，异源表达 已有1人参与
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我是做酶的，我在异源表达好后，培养破碎得到粗酶液，检测有活性，但是在做镍柱纯化时，感觉蛋白不挂柱子，我是在蛋白质双端都加上了6xhis标签，求大神们，帮忙解答一下，该怎么做。 @天使托 发自小木虫手机客户端 |
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2楼2026-01-20 13:57:09
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谢谢，这个是可溶性蛋白，我每次都是破碎得到粗酶液，然后12000rpm离心20min后去检测上清液的酶活的，有酶活后再去做的纯化，纯化时反复用粗酶液过柱子3-4遍，然后先用40mM的咪唑溶液洗去杂蛋白，100-500mM咪唑溶液探究目的蛋白洗脱浓度，用蛋白质定量试剂G250实时检测洗脱液中蛋白浓度，但是做了几次都是40mM就洗出来了大部分蛋白，然后100mM洗出一点，200-500逐渐减少了，每个浓度洗脱液都用了四杯柱，用底物检测酶活时，过柱子剩下的粗酶液中酶活最高，40mM咪唑溶液中酶活较高，100-500与前者比断档级降低。 发自小木虫手机客户端 |
3楼2026-01-20 16:23:00
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蛋白胶我正在做，等出来再看看结果，其实有人推荐我用MBP大标签，但是这个标签可能会影响酶的空间结构进而影响酶活，最主要的是这个表签需要切除，酶切反应要过夜，所以无法第一时间进行实验，一直在考虑要不要用，想问一下大家还有没有什么好的方法。  发自小木虫手机客户端 |
4楼2026-01-20 16:26:54