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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于分子生物学的最新实验技术
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hxdon

铜虫 (著名写手)

关于酵母单双杂交系统

★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+5,VIP+0): 11-21 19:09
在看一篇文献，是这样写的：
单双杂交体系融合了酵母单杂交和双杂交体系的原理，又同时应用DNA-蛋白质以及蛋白质-蛋白质之间的相互作用筛选CDNA文库。如果DNA结合序列以及与DNA序列相互作用的转录因子均为已知，就可以用该系统筛选新的转录因子了。
希望高手解释一下：
1第一句话中说的筛选CDNA文库是怎么实现的，从理论上帮我理一理。
2 第二句话中说的转录因子已知，是指它的蛋白结构还是已经纯化好了这个蛋白，就是说“已知”是指具体的什么已知了！
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11楼2009-11-15 12:23:54
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hxdon

铜虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
amisking(金币+4,VIP+0): 11-21 19:09
在看一篇文献，是这样写的：
单双杂交体系融合了酵母单杂交和双杂交体系的原理，又同时应用DNA-蛋白质以及蛋白质-蛋白质之间的相互作用筛选CDNA文库。如果DNA结合序列以及与DNA序列相互作用的转录因子均为已知，就可以用该系统筛选新的转录因子了。
希望高手解释一下：
1第一句话中说的筛选CDNA文库是怎么实现的，从理论上帮我理一理。
2 第二句话中说的转录因子已知，是指它的蛋白结构还是已经纯化好了这个蛋白，就是说“已知”是指具体的什么已知了！
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12楼2009-11-15 12:24:28
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hxdon

铜虫 (著名写手)
★ ★ ★
amisking(金币+3,VIP+0): 11-21 19:09
在看一篇文献，是这样写的：
单双杂交体系融合了酵母单杂交和双杂交体系的原理，又同时应用DNA-蛋白质以及蛋白质-蛋白质之间的相互作用筛选CDNA文库。如果DNA结合序列以及与DNA序列相互作用的转录因子均为已知，就可以用该系统筛选新的转录因子了。
希望高手解释一下：
1第一句话中说的筛选CDNA文库是怎么实现的，从理论上帮我理一理。
2 第二句话中说的转录因子已知，是指它的蛋白结构还是已经纯化好了这个蛋白，就是说“已知”是指具体的什么已知了！
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13楼2009-11-15 12:25:28
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hxdon

铜虫 (著名写手)
发多了，
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14楼2009-11-15 12:26:45
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hooter86

金虫 (小有名气)
★
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分子生物学已经沦为一种工具，不再是什么恨恨神秘的玩意了。但是如何使用这种工具就在于个人的造化造诣了。
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15楼2009-11-15 15:48:07
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biozheng

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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amisking(金币+7,VIP+0): 11-21 19:08
变性梯度凝胶电泳（DGGE）、温度梯度凝胶电泳（TGGE）

原理：双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA 片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。DGGE/TGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA 片段区分开来。一个特定的DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域(meltingdomain, MD)和解链行为(melting behavior) 。一个几百个碱基对的DNA 片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成。当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区域浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。当浓度度再升高依次达到各其他解链区域浓度时，这些区域也依次发生解链。直到变性剂浓度达到最高的解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA 完全解链。
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16楼2009-11-16 18:08:47
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695

木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+17,VIP+0): 11-21 19:08
ChIP与蛋白质组研究
染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecitation，ChIP）是研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。它可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。核小体组蛋白可以发生多种翻译后的共价修饰，如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，这些共价修饰与真核基因的表达密切相关。根据“组蛋白密码”假说，组蛋白的各种共价修饰的组合会以协同或拮抗的方式诱导特异的下游生物学功能，因此，ChIP也为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用，全面阐明真核基因的表达调控机制提供了强有力的研究工具。

真核生物细胞状态是由内源和外源因素共同影响的，所有信号传递途径的终点都是DNA。DNA通过核蛋白复合物组成染色质，染色质是基因调控的一个重要作用位点。转录激活因子和辅助抑制因子的研究显示存在一种新的调节机制--“组蛋白密码”，其信息存在于组蛋白的转录后修饰等过程中。该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。随着越来越多组蛋白核心结构区域和羧端修饰的确定，组蛋白密码在控制和调节基因功能过程中的作用越来越明确。参与修饰的酶根据其作用的不同而分类：如组氨酸乙酰转移酶（HATs）可以将乙酰基团转到组蛋白上；组蛋白去乙酰酶（HDACs）可以去除氨基酸上的乙酰基团；组蛋白甲基转移酶（HMTs）可以将甲基基团转移到组蛋白上等不同组氨酸修饰标记对应于不同的生物学过程，它可以作为调节因子的作用位点，也可以用来改变染色质结构。

染色质免疫沉淀分析（ChiP）是基于体内分析发展起来的方法，它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着CHIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

凝胶电泳迁移率改变分析（EMSA）是目前研究转录调控蛋白和相应核苷酸序列结合的常用方法，但是由于许多转录调控蛋白有相似或相同的DNA结合位点，这种体外分析获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和DNA结合的状况。染色质免疫沉淀分析（ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。ChIP技术和芯片技术的结合有利于确定全基因组范围内染色体蛋白的分布模式以及组蛋白修饰情况。ChIP基本试剂盒和特定蛋白质抗体结合完成一个染色质免疫沉淀分析。

该技术主要应用于：

1.组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”

2.转录调控分析

3.药物开发研究

4.有丝分裂研究

5.DNA损失与凋亡分析
——转
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17楼2009-11-16 22:52:29
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linxi8579

铜虫 (正式写手)

RNAi

★ ★ ★ ★ ★ ★
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amisking(金币+5,VIP+0): 11-21 19:08
RNAi is very hot nowdays,很多人和事实都证明了这一点。从发现到拿诺贝尔到之后的发展，说明RNAi真的是一项重要而实用的技术。目前研究发现主要在大型生物即动植物和病毒中的RNAi现象，但是推断各生物起码是真核生物应普遍存在这一现象。体内的非编码小RNA--microRNA，可以在转录后或翻译前水平通过降解mRNA或抑制翻译参与基因表达的调节，也许RNAi的研究对基因表达的调节又是一个突破，我们在期待。
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18楼2009-11-17 09:55:38
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hxdon

铜虫 (著名写手)
有没有高手知道Chip-PET的测序原理，以及应用范围?
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19楼2009-11-17 17:00:23
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phellinus

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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amisking(金币+3,VIP+0): 11-21 19:09
微卫星标记（microsatellite），
又称为短串联重复序列(simple tandem repeats,STRs)或简单重复序列（simple sequence repeats），是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由2～6个核苷酸的串联重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫星标记的应用非常广泛。微卫星位点通常通过PCR扩增，扩增产物通过电泳分析并根据大小分离等位基因进行检测。PCR扩增后的等位微卫星可以用多种方法检测，如荧光标记、银染。 微卫星存在于大多数生物的基因组中，被广泛的应用于遗传杂交育种和绘制染色体遗传图谱等领域。高度多态的微卫星还可以用来在人群进行个体识别。
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20楼2009-11-18 13:14:52
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