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hxdon

铜虫 (著名写手)

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[交流] 关于分子生物学的最新实验技术

分子生物学的实验技术发展实在是太快了！虽然在这个圈里混，但仍有很多不明白的甚至没听说过的实验技能。希望大家踊跃跟帖，收集最新的实验技术！

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1楼 2009-11-12 18:31:57

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木虫 (职业作家)

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专业: 植物生理与生化

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amisking(金币+17,VIP+0): 11-21 19:08

ChIP与蛋白质组研究
染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecitation，ChIP）是研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。它可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。核小体组蛋白可以发生多种翻译后的共价修饰，如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，这些共价修饰与真核基因的表达密切相关。根据“组蛋白密码”假说，组蛋白的各种共价修饰的组合会以协同或拮抗的方式诱导特异的下游生物学功能，因此，ChIP也为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用，全面阐明真核基因的表达调控机制提供了强有力的研究工具。

真核生物细胞状态是由内源和外源因素共同影响的，所有信号传递途径的终点都是DNA。DNA通过核蛋白复合物组成染色质，染色质是基因调控的一个重要作用位点。转录激活因子和辅助抑制因子的研究显示存在一种新的调节机制--“组蛋白密码”，其信息存在于组蛋白的转录后修饰等过程中。该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。随着越来越多组蛋白核心结构区域和羧端修饰的确定，组蛋白密码在控制和调节基因功能过程中的作用越来越明确。参与修饰的酶根据其作用的不同而分类：如组氨酸乙酰转移酶（HATs）可以将乙酰基团转到组蛋白上；组蛋白去乙酰酶（HDACs）可以去除氨基酸上的乙酰基团；组蛋白甲基转移酶（HMTs）可以将甲基基团转移到组蛋白上等不同组氨酸修饰标记对应于不同的生物学过程，它可以作为调节因子的作用位点，也可以用来改变染色质结构。

染色质免疫沉淀分析（ChiP）是基于体内分析发展起来的方法，它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着CHIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

凝胶电泳迁移率改变分析（EMSA）是目前研究转录调控蛋白和相应核苷酸序列结合的常用方法，但是由于许多转录调控蛋白有相似或相同的DNA结合位点，这种体外分析获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和DNA结合的状况。染色质免疫沉淀分析（ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。ChIP技术和芯片技术的结合有利于确定全基因组范围内染色体蛋白的分布模式以及组蛋白修饰情况。ChIP基本试剂盒和特定蛋白质抗体结合完成一个染色质免疫沉淀分析。

该技术主要应用于：

1.组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”

2.转录调控分析

3.药物开发研究

4.有丝分裂研究

5.DNA损失与凋亡分析
——转