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是否清楚Western Blot中 浓缩胶和分离胶的区别与作用
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1什么是Western blot?蛋白质免疫印迹是分子生物学实验中常用的技术，通过电泳分离蛋白、转膜后利用抗体特异性结合来检测样品中目标蛋白质的技术。主要步骤包括：①电泳分离（使用凝胶把混合蛋白按分子量大小分开，就是我们今天聊的环节）；②转膜（把凝胶上的蛋白“转移”到硝酸纤维素膜或PVDF膜等载体上）；③孵育（用特异性抗体孵育目的蛋白）；④显影（通过化学发光等方式让目的蛋白显现形成清晰条带）。 而完成这一切的前提，就是①电泳能把蛋白清晰的分开，也就是需要使用到分离胶，使用分离胶我们可以很好的理解，但是实验过程还需要浓缩胶的配合，那么为什么呢？ 2分离胶与浓缩胶的成分差异 3浓缩胶的作用浓缩胶，顾名思义，就是将蛋白样本进行浓缩，使得样本孔中的蛋白质样本压缩到一条窄窄的起跑线，确保所有的样本同时进入分离胶分离。为什么它能做到浓缩这一点呢？首先浓缩胶的浓度通常很低（一般为5%），所以对应的凝胶孔径大；其次，浓缩胶的pH值通常为6.8，而分离胶是8.8，这种pH差异源于两者缓冲液成分的不同——浓缩胶用Tris-HCl（pH6.8），分离胶用Tris-HCl（pH8.8）在电泳的时候，缓冲液里的氯离子（Cl⁻）是跑得最快，甘氨酸（在pH6.8环境中解离少，带电荷少）是跑得较慢，而蛋白质介于两者之间。当电场启动后，氯离子快速向前冲，甘氨酸慢悠悠跟在后面，两者之间形成一个“低离子浓度区”。蛋白质会被这个“浓度差”推着向前，逐渐聚集到氯离子和甘氨酸之间的“夹缝”里，原本分散在孔里的样品，就被压缩成了一条极窄的条带。 4分离胶的作用分离胶，顾名思义，就是用来分离蛋白的啦。分离胶浓度更高（8%-15%），孔径更小。成分上，丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺总用量高于浓缩胶（缩小孔径），缓冲液为pH8.8的Tris-HCl（维持分离环境）。这种小孔径结构形成分子筛效应：小分子蛋白易穿过孔径，迁移至凝胶下方；大分子蛋白受阻，停留于上方，实现按分子量排序分离。此外pH8.8的碱性环境还能让甘氨酸大量解离为带负电的甘氨酸根，移动速度超过蛋白质，使蛋白失去“推动”作用，仅靠自身电荷和分子筛效应迁移。   |
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