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[交流]
用简并引物扩增核心片段的结果……
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前几天终于把用简并引物扩增出来的片段测序出来了，满怀期望但结果却令我很是失望…… 事情是这样的： 我要做一个未知基因的cDNA克隆，现在先做核心片段的克隆，准备后面再做RACE。我用CODEHOP设计的简并引物，但没有完全按照它设计的引物，我做了一些修改。 在最近缘的物种中，我设计的几对引物的目的片段是300-490bp，在PCR扩增后，得到大小约为550bp的片段(这个应该还是可以的吧，物种之间有点差异还是比较正常的呃)。接着做好克隆测序之后，得到序列553bp(包括引物序列在内)，测序很成功，上下游引物都找到了。 但是，我把测出的序列在ncbi上blast后(用核苷酸blast核苷酸，核苷酸blast蛋白都做过)，下面出来的却没有一个信息是跟我的基因有关的，这就是说 失败了 ！ 然后我再回过头来查找原因，觉得肯定是引物有问题，然后这几天就在重新设计简并引物，可是设计来设计去，觉得也差不多就那样了吧。 所以特此发帖，跟广大虫友交流一下，大家发表一下看法，给我点建议！在此先谢过了！ PS:当初设计引物的时候，用claustal比对了蛋白质，因为我的物种的同源物种比较少（同一个目的只有一个），所以比对后发现保守性一般，但是还是找到保守的区域，连续的六个氨基酸还是有的，但是就是在这样的地方设计的。 |
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