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[交流]
怎么证明一个蛋白是转录因子
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各位战友，我最近发现了一个入核的蛋白，最近正在做这个蛋白的功能研究。我想先鉴别或者证明此蛋白是不是转录因子，因为目前还没有报过这个蛋白的入核倾向。 请问我该从哪方面入手呢？怎么证明这个蛋白是不是与DNA结合？如果结合怎么找到结合的DNA序列？ 谢谢大家。。。 |
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2楼2009-11-11 09:04:35
红多多
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呵呵 1你要纯化蛋白并对其进行序列和结构分析， 2你要将蛋白的和DNA的结合部位找到（ChIP可以做到，需要的是能制备蛋白的抗体） 3 酵母单杂交，在报告基因上游克隆你的蛋白结合的启动子，将你的目标蛋白加入体系看能否表达，表达就说明是转录因子，否则不是。 当然，可能你的目标蛋白不能和DNA结合，那么你在做ChIP的时候就会发现没有DNA与蛋白的结合，也可能你的蛋白只和DNA结合但不能激活转录的起始，这就需要你通过蛋白的结构将蛋白质的DNA结合区与一广谱转录激活因子结合，从而验证其功能。 ChIP：染色体免疫共沉淀 第一步：用甲醛在体内将DNA结合蛋白与DNA交联 第二步：分离染色体（质），剪切后的DNA小片段与结合蛋白结合 第三步：用特异性抗体与DNA结合蛋白结合，用沉淀法分离复合体。反向交联操作释放出DNA，并消化蛋白质 第四步：用PCR扩增特异DNA序列，以确定是否与抗体共沉淀 |
3楼2009-11-11 09:32:15
4楼2009-11-12 16:36:47