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gydgs033

金虫 (小有名气)

[交流] PCR反应体系参数设置

弱弱的问一下。
1。最近看了些PCR相关的文章,体系设置参数时最后都有一个72℃延伸10 min或5min.作用是什么呢?
如下面这个体系:95℃ 预变性4 nfin;95 oC变性30 s,52 oC退火30 s,72℃ 延伸30 S,30个循环,72℃延伸10 min。
2。另外,在跑DNA琼脂糖电泳时,加多少电压比较合适呢,文献给的是5V/CM.我们实验室用的是80~100V的电压,按距离换算也换算不到这个,还有,我们的电压为什么总是在波动呢,而且用了稳压器也不管用,师兄说这个没关系,请教高手解答一下
3。我们跑的电泳经常所有的条带不是同时入电泳液,但又必须等到跑的最慢的快入水才能关电泳仪,怎么解决这个问题呢
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1949stone

荣誉版主 (知名作家)

海纳百川

★ ★
gydgs033(金币+2,VIP+0):谢谢指教,还是不太明了,能否再回答细点 11-11 20:36
1延伸是为了更好的聚合,五分 十分 都是有实验依据的 你要做实验在得出 一般用十分钟
2电压你给出的就可以,不过不建议用高电压,发热厉害。电压不稳又是波动很正常,不用在意
3跑的时间久一点啊
海纳百川止于至善
2楼2009-11-10 22:08:56
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mcl49510

铜虫 (小有名气)


gydgs033(金币+1,VIP+0):谢谢 11-11 20:36
1我觉得是为了使可能在循环中没有合成完的DNA再最后10min的延伸中合成为完整的,提高产量。
2你们是不是用的横流,不是恒压啊?
3楼2009-11-11 01:55:50
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gydgs033

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 1949stone at 2009-11-10 22:08:
1延伸是为了更好的聚合,五分 十分 都是有实验依据的 你要做实验在得出 一般用十分钟
2电压你给出的就可以,不过不建议用高电压,发热厉害。电压不稳又是波动很正常,不用在意
3跑的时间久一点啊

关于问题1:如果是为了更好的聚合,那应该在每一轮之后都延伸10分钟或5分钟呀,为什么所有的体系都是最后才72度延伸10分呢?
问题3:如果跑的太久,会不会最先入水的条带跑出凝胶,而最后一条还没入水呢?有没有什么办法可以让各条带同时入水呢?
4楼2009-11-11 20:35:45
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六妖妖

金虫 (正式写手)

我只是不太明白lz的第三个问题。什么叫同时入水?为什么要同时入水?lz做PCR的目的是什么?
5楼2009-11-12 10:19:45
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