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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求租引物上酶切位点的问题！
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陌默

[交流] 求租引物上酶切位点的问题！

扩增细菌的16S rDNA的通用引物，能否在上下游分别添加ECoRI和HindⅢ酶切位点啊？

上游：AGAGTTTGATCCTGG

下游：ACGGCTACCTTGTTA



就是为了细菌分类和鉴定，想做TA克隆，所以需要加酶切位点，不知上面两个酶切位点可否？

急求高手指点！
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1楼 2009-11-09 13:02:58
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
既然做TA克隆为何还要在引物上面加酶切位点？
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2楼2009-11-09 13:08:09
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jjlbest

木虫 (著名写手)
★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 11-10 12:38
我也想问的是1楼的问题，连接T载体是不需要酶切位点的，普通的Taq酶扩增后自动在DNA的3‘端加上一个A。可直接与Tvector连接的，如用高保真酶如Primerstar，扩增后的DNA产物无A，只要加上A尾就可以了，一般情况下，要进行定位克隆时才用到酶切位点的e
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3楼2009-11-09 13:44:01
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
我想楼主大概希望TA克隆后筛重组子用双酶切鉴定下。这样没必要，可以直接做PCR鉴定，即使酶切鉴定的话，T载上也有现成的酶切位点。
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Thank-you，so-blue.
4楼2009-11-09 14:18:39
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zier1011

木虫 (著名写手)
俺想问的也是1楼的疑问，既然是要做TA克隆，为什么还要加酶切位点？楼主说错了吧，不是做TA克隆，而是想通过酶切连接的方法构建到质粒上吧
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花还香香的
5楼2009-11-09 14:29:24
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陌默

引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2009/11/9 14:18:
我想楼主大概希望TA克隆后筛重组子用双酶切鉴定下。这样没必要，可以直接做PCR鉴定，即使酶切鉴定的话，T载上也有现成的酶切位点。

对，我就是要筛重组子，所以想用PCR和酶切鉴定，觉得这样保险点啊。我就想知道，我能不能用EcoRI 和HindⅢ来做酶切呢？？
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6楼2009-11-09 21:06:49
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陌默

引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2009/11/9 13:08:
既然做TA克隆为何还要在引物上面加酶切位点？

表述错误了，是TA克隆后，筛重组子哈~
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7楼2009-11-09 21:07:57
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★
陌默(金币+1,VIP+0): 11-10 12:21
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2009-11-9 14:18:
我想楼主大概希望TA克隆后筛重组子用双酶切鉴定下。这样没必要，可以直接做PCR鉴定，即使酶切鉴定的话，T载上也有现成的酶切位点。

用的T载体一般并且最后都是simple的吧，不加酶切位点的。
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8楼2009-11-09 22:26:57
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陌默

引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2009/11/9 22:26:

用的T载体一般并且最后都是simple的吧，不加酶切位点的。

还是有点没明白哦，如果我想用酶切鉴定的话，不用再我的引物上加酶切位点？因为T载体上本身就有，所以直接酶切重组子就可以了么？？
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9楼2009-11-09 22:51:44
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
陌默(金币+1,VIP+0): 11-10 12:21
引用回帖:
Originally posted by 陌默 at 2009-11-9 21:06:

对，我就是要筛重组子，所以想用PCR和酶切鉴定，觉得这样保险点啊。我就想知道，我能不能用EcoRI 和HindⅢ来做酶切呢？？

可以的，T载上有这两个酶切位点。
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Thank-you，so-blue.
10楼2009-11-10 09:38:47
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