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[交流] 【求助】a淀粉酶最适温度的测定以及温度耐受性的测定实验方案

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1楼 2009-11-08 18:06:19

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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

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对吻鱼(金币+2,VIP+0):鼓励应助~~欢迎常来化工版^_^ 12-11 12:20

摘录自我写的专利，供参考

三、青霉（Penicillium）淀粉酶的最适作用温度
将粗酶液稀释至5倍体积，作为待测酶液A；将粗酶液稀释至5倍体积，煮沸5min灭活，作为待测酶液B（空白对照）。
1、将可溶性淀粉溶于pH4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，得到淀粉溶液（每100毫升溶液中含有0.25克可溶液淀粉）。
2、在350µL淀粉溶液中加入50µL待测酶液，分别在15-70℃（以5℃作为温度梯度）反应15min。
3、加两倍体积DNS终止反应并煮沸5min显色。
4、测定540 nm 的光吸收值，计算酶活力。
设置三次重复试验，结果取平均值。
将待测酶液的酶活力乘以稀释倍数，得到粗酶液的酶活力。粗酶液的酶活力为：15.45 U/mL（15℃）、19.10 U/mL（20℃）、22.81 U/mL（25℃）、30.00 U/mL（30℃）、33.87 U/mL（35℃）、35.96 U/mL（40℃）、37.25 U/mL（45℃）、33.34 U/mL（50℃）、25.71 U/mL（55℃）、17.09 U/mL（60℃）、11.20 U/mL（65℃）、5.47 U/mL（70℃）。
以最高酶活力作为100％，其他温度的酶活力折算为相对于最高酶活力的相对酶活力。以温度为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，见图6。
结果表明，青霉淀粉酶的最适作用温度约为45℃。
四、青霉（Penicillium）淀粉酶的温度耐受性
将粗酶液稀释至4倍体积，作为酶液A；将粗酶液稀释至4倍体积，煮沸5min灭活，作为酶液B（空白对照）。取若干份酶液A，分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃下保温1-6h；同样，取若干份酶液B，分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃下保温1-6h。
1、将可溶性淀粉溶于pH4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，得到淀粉溶液，各淀粉溶液中淀粉的终浓度均为0.25%（每100毫升溶液中含有0.25克可溶液淀粉）。
2、每350µL淀粉溶液中加入50µL不同温度处理后酶液，30℃反应1小时。
3、加两倍体积DNS终止反应并煮沸5min显色。
4、测定540 nm 的光吸收值，计算酶活力。
设置三次重复试验，结果取平均值。
将待测酶液的酶活力乘以稀释倍数，得到粗酶液的酶活力。粗酶液的酶活力为： 35℃处理1h:30.00 U/mL、2h: 29.96 U/mL、3h: 30.00 U/mL、4h: 30.00 U/mL、5h: 29.38 U/mL、6h: 29.18 U/mL；40℃处理1h:23.81 U/mL、2h: 21.48 U/mL、3h: 20.71 U/mL、4h: 16.84 U/mL、5h: 14.12 U/mL、6h: 12.88 U/mL；45℃处理1h:5.64 U/mL、2h: 2.24 U/mL、3h: 0 U/mL；50℃处理1h:1.29 U/mL、2h:0U/mL
以步骤一测定的粗酶液的酶活力作为100%，将不同温度和时间处理后酶液的酶活力折算为相对酶活力。以温度为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，见图7。
结果表明，青霉淀粉酶在40℃保温1h后活性开始稍有丧失，在50℃保温1h后活性几乎全部丧失，说明该淀粉酶对温度比较敏感。

在做温度耐受性时可以考虑将淀粉酶加到某一pH值的缓冲液中，测定在该pH值下的温度耐受性。