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夏末～易科

新虫 (小有名气)

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WB实验原理及流程
Western Blot（WB）实验原理及流程图
一、实验原理
Western Blot（免疫印迹）是一种用于检测特定蛋白质在复杂样本中表达水平的技术。其原理基于以下三个核心步骤：
1. 蛋白质分离
通过 SDS-PAGE 凝胶电泳将蛋白质按分子量大小分离。
SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质携带大量负电荷，掩盖天然电荷差异，确保分离仅基于分子量。
PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）提供分子筛效应，小分子量蛋白迁移更快，大分子量蛋白迁移更慢。
2. 蛋白质转膜
将凝胶中分离的蛋白质转移到固相载体膜（如 PVDF 膜或 NC 膜）上，便于后续抗体结合。
常用转膜方法：湿转法（传统）或半干转法（快速）。
3. 抗体检测
一抗：特异性识别目标蛋白的抗体。
二抗：携带标记（如 HRP 酶、荧光基团）的抗体，识别一抗的 Fc 段。
信号检测：通过化学发光（ECL）或荧光显色，使目标蛋白条带可视化。
二、实验流程图
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1. 样品制备
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2. SDS-PAGE 电泳分离蛋白质
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3. 转膜（将蛋白质转移到膜上）
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4. 封闭（5% 脱脂牛奶或 BSA，阻断非特异性结合）
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5. 一抗孵育（特异性结合目标蛋白）
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6. 洗涤（去除未结合的一抗）
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7. 二抗孵育（标记的二抗结合一抗）
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8. 洗涤（去除未结合的二抗）
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9. 检测（ECL 化学发光或荧光成像）
三、关键步骤详解
1. 样品制备
裂解细胞/组织，提取总蛋白，测定浓度后与上样缓冲液混合并煮沸变性。
2. 电泳
上样后通电，小分子量蛋白迁移至凝胶下端（可根据预染 Marker 判断分离效果）。
3. 转膜
电流方向垂直于凝胶平面，蛋白质从凝胶转移至膜上（需确认转膜效率，如丽春红染色）。
4. 封闭
使用封闭液（如脱脂牛奶）覆盖膜表面，减少抗体非特异性吸附。
5. 抗体孵育
一抗孵育常需过夜（4℃），二抗孵育时间较短（室温 1-2 小时）。
6. 信号检测
化学发光法：HRP 催化底物发光，通过胶片或成像系统捕获信号。
四、注意事项
对照设置：需包含阴性对照（无目标蛋白样本）、内参（如 β-actin/GAPDH）及空白对照。
抗体选择：验证一抗特异性，避免交叉反应。
时间控制：转膜时间过长可能导致小分子量蛋白穿透膜。
发自小木虫手机客户端

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