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RNA提取全攻略：Trizol法超详细步骤
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做分子生物学实验，RNA提取可是基础中的基础！今天就来给大家详细讲讲Trizol法提取RNA的全过程，超实用，赶紧码住！ Trizol法提取RNA的基本原理 1️⃣ 细胞裂解 Trizol试剂里的异硫氰酸胍是个“狠角色”，能迅速破坏细胞结构，让核酸和蛋白质都释放出来。它还能抑制核酸酶活性，保护RNA不被降解，厉害吧！ 2️⃣ RNA分离 裂解后，加入氯仿离心。氯仿密度大，能和苯酚结合，把RNA赶到水相里，而DNA和蛋白质则留在有机相或中间相。这样，RNA就和其他成分分开了！ 3️⃣ RNA沉淀 收集上层水相，加入异丙醇，RNA就会沉淀出来。这一步超关键，决定了RNA能不能被成功回收。 4️⃣ RNA洗涤与纯化 用乙醇洗涤RNA沉淀，去除杂质和残留溶剂。最后用无RNase的水溶解RNA，就得到纯净的总RNA啦！ 🌟 Trizol法中各个试剂的作用 1️⃣ Trizol试剂 异硫氰酸胍：强力蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，释放RNA，还能抑制核酸酶活性。 苯酚：帮助裂解细胞，释放核酸和蛋白质，但需要和其他成分联合使用才能更好地抑制RNA酶活性。 8-羟基喹啉：能抑制RNase活性，和氯仿联合使用时效果更佳。 β-巯基乙醇：破坏RNase蛋白质中的二硫键，进一步抑制RNase活性。 2️⃣ 氯仿 加速有机相和水相分层，让RNA留在水相中，同时抽提少量苯酚，减少对RNA的损害。 3️⃣ 乙醇 去除沉淀中残留的异丙醇和其他杂质，提高RNA纯度。 4️⃣ DEPC水 无RNase的水，防止RNA在溶解过程中被降解。 提取12孔板细胞RNA的超详细步骤 1️⃣ 裂解细胞 12孔板每孔加入700 μL Trizol试剂，室温裂解10分钟，让核酸蛋白复合物完全分离。然后用枪吹打细胞，转移至新的EP管中。 2️⃣ 加入氯仿 每管加入140 μL三氯甲烷（Trizol体积的1/5），剧烈震荡15秒，室温放置3分钟。然后12000 rpm，4℃离心20分钟，样品会分成三层，RNA主要在上层水相中。 3️⃣ 收集水相 小心转移上层水相（300 μL）至新的EP管中，操作要格外小心，不要吸取到有机相。加入等量体积300 μL的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟，让RNA沉淀。 4️⃣ 沉淀RNA 12000 rpm，4℃离心15分钟，弃上清。然后加入1 mL 75%乙醇，8000 rpm，4℃离心5分钟，重复2次洗涤，提高RNA纯度。 5️⃣ 干燥RNA 离心结束后，用吸引器将乙醇吸取干净，室温放置晾干RNA沉淀，一般2-5分钟即可，切勿干燥过度。 6️⃣ 溶解RNA 加入适量DEPC水，用枪头吸打几次，让RNA充分溶解。 毕合生物提供服务内容：分子生物学、免疫, 重组蛋白及ELISA相关、活性小分子化合物、高端化学、材料化学、细胞资源库与培养相关、生命科学、天然产物 |
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