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【原创】发一个关于Tail PCR的操作流程！！！
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这个是牛津大学植物科学系朗戴尔实验室里使用的Tail-PCR操作流程。 ------Langdale Lab, Department of Plant Sciences, University of Oxford 顺便介绍一下Tail-PCR Tail-PCR，即热不对称交错PCR，英文全称为：Thermal Asymmetric Interlaced PCR.能够较好地解决分离与已知RNA序列邻近的未知序列,以便基因克隆和分子杂交的探针的制备。 TAIL-PCR技术简单易行，反应高效灵敏，产物的特异性高，重复性好，能够在较短的时间内获得目标片段，已经成为分子生物学研究中的一种实用技术。经改良过的TAIL-PCR成功地从突变体中克隆到外源插入基因的旁侧序列，从而为启动子的克隆提供了有效的新方法。 在利用特异引物和随机引物进行PCR中一般有3种产物生成： ①由特异性引物和简并引物扩增出的产物； ②由同一特异性引物扩增出的产物； ③由同一简并引物扩增出的产物。 在TAIL-PCR反应中，其中后2种目标产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。TAIL-PCR的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物（special primer，简称sp1，sp2，sp3，约20bp），用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物（arbitrary degenerate prime，AD，约14bp）相组合，以基因组RMA为模板，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。TAIL-PCR共分3次反应。 第一次反应包括5次高特异性、1次低特异、10次较低特异性反应和12个热不对称的超级循环。5次高特异性反应，使sp1与已知的序列退火并延伸，增加了目标序列的浓度；1次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上；10次较低特异性反应使2种引物均与模板退火，随后进行12次超级循环。经上述反应得到了不同浓度的3种类型产物：特异性产物①型和非特异性产物（②型和③型）。 第二次反应则将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板，通过10次热不对称的超级循环，使特异性产物被选择地扩增，而非特异产物含量极低。第三次反应又将第二次反应的产物稀释作模板，再设置普通的PCR反应或热不对称超级循环，通过上述3次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。 纳米盘下载地址： http://d.namipan.com/d/An%20intr ... 677529f5a8e00fa0e00 [ Last edited by 三个小石子 on 2009-12-25 at 16:43 ] |
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