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Longlight

铁虫 (初入文坛)

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[交流] 如何精准定量核酸浓度

一、紫外分光光度法（Nanodrop）
原理：核酸的碱基（嘌呤、嘧啶）在260 nm波长处有最大紫外吸收峰，通过吸光值（A260）结合摩尔吸光系数计算浓度。DNA的换算系数为50 μg/mL，RNA为40 μg/mL。
特点：
• 操作简便，1分钟内完成检测。
• 无法区分DNA/RNA、降解核酸及杂质，需结合A260/A280（>1.8为DNA纯品，>2.0为RNA纯品）评估纯度。
• 灵敏度较低（≥2 ng/μL），易受游离核苷酸干扰。

二、荧光染料法（如达远辰光荧光计）
原理：特异性荧光染料（与目标核酸结合后发出荧光，通过荧光强度定量。例如，达远辰光荧光计搭配赛默飞Qubit dsDNA HS染料检测范围为0.2–100 ng/μL。
特点：
• 灵敏度高（pg级），特异性强，可区分DNA/RNA。
• 耗材成本相较于紫外分光法较高。
• 适用于低浓度/珍贵样本（如NGS文库）。

三、实时荧光定量PCR（qPCR）
原理：通过荧光染料或探针实时监测PCR扩增过程，Ct值与起始模板浓度呈线性关系，结合标准曲线定量。
特点：
• 特异性高，依赖引物/探针设计，可检测拷贝数。
• 操作复杂，耗时较长，需标准品确保扩增效率一致。
• 适用于基因表达分析、病原体检测等。

四、传统化学法
1. 定磷法
• 原理：核酸中的磷在酸性条件下与钼酸铵反应生成钼蓝，在650 nm处测吸光值，换算浓度。DNA/RNA含磷量分别为9.2%和9.5%。
• 特点：灵敏度较高（1–10 μg），但易受蛋白质干扰。
2. 定糖法
• 原理：核酸戊糖经酸解生成醛类，与成色剂（如苔黑酚）反应显色，670 nm或595 nm测吸光值。
• 特点：操作简单，但特异性差，仅适用于粗略估算。

五、其他方法
1. 毛细管电泳法
• 原理：基于荧光染料结合核酸，通过迁移时间和峰面积定量，可评估核酸完整性（如RNA降解程度）。
• 特点：灵敏度高（25 ng/μL），但单样成本较高。
2. 数字PCR（dPCR）
• 原理：将样本分割成微滴独立扩增，统计阳性微滴数实现绝对定量，不受扩增效率影响。
• 特点：适用于稀有突变检测、病毒载量测定等。

选型建议
• 常规检测：优先选择紫外分光光度法（快速便捷）或Qubit荧光法（高灵敏度）。
• 复杂样本：如NGS文库，推荐毛细管电泳或数字PCR。
• 绝对定量需求：使用qPCR或数字PCR

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1楼 2025-04-02 17:53:00

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