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南方科技大学公共卫生及应急管理学院2025级博士研究生招生报考通知
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zhouxw125

铁虫 (初入文坛)

[交流] 关于测序,空载体

大家好!不知道有没有人遇到过这样的情况呢?

我做了连接转化后,先是用自己的引物做了菌液PCR检测,结果假阳性比较多,测出的都是空载体。然后我又用M13通用引物做了菌液pcr检测阳性克隆,送至华大基因测序,结果现在测出的序列都是载体上的序列,完全不是我要的结果,跟第一次差不多。有没有人遇到到过同样的情况呢,分享一下经验

我的目的基因片段是600bp左右,测序的几个结果都是1000多个bp,根本不是我要的序列

[ Last edited by amisking on 2009-11-1 at 14:27 ]
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黑罕

金虫 (小有名气)

★ ★
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amisking(金币+1,VIP+0): 11-1 16:21
你的连接有问题
1、找人检查你的实验方案是否有问题
2、检查你用的酶是否有效
2楼2009-11-01 14:37:00
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

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amisking(金币+1,VIP+0): 11-1 16:21
呵呵,XW啊,实验出问题了才来小木虫逛啊。
还是那个原因。
菌液PCR一定要记得做阴性对照。
Thank-you,so-blue.
3楼2009-11-01 15:17:13
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我爱吃水果

金虫 (正式写手)

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amisking(金币+2,VIP+0): 11-1 16:22
用基因特异引物检测室空载体那肯定就是空的了
没必要还用M13,更不要测序
重新挑克隆
不行只能重做连接转化
爱学习!爱运动!我爱吃水果!o(∩_∩)o...哈哈
4楼2009-11-01 16:17:46
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)

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amisking(金币+1,VIP+0): 11-1 17:09
1、M13通用引物做了菌液pcr检测阳性克隆后又用你自己的引物检测过了吗?
2、测出来的1000多bp是一个测序反应的长度,你可以再反向比对下看看有没有正确的。
5楼2009-11-01 16:58:49
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zhouxw125

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by 黑罕 at 2009-11-1 14:37:
你的连接有问题
1、找人检查你的实验方案是否有问题
2、检查你用的酶是否有效

恩,我现在正在改进实验方法,重新做一遍试试,谢谢
6楼2009-11-05 19:25:20
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zhouxw125

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2009-11-1 15:17:
呵呵,XW啊,实验出问题了才来小木虫逛啊。
还是那个原因。
菌液PCR一定要记得做阴性对照。

哈哈,S啊,你是天天来啊,我也经常来看帖子地
7楼2009-11-05 19:26:20
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zhouxw125

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by 我爱吃水果 at 2009-11-1 16:17:
用基因特异引物检测室空载体那肯定就是空的了
没必要还用M13,更不要测序
重新挑克隆
不行只能重做连接转化

不一定啊,用基因特异性引物做检测也会有误的,原因跟M13一样。
“PCR只能说明菌液里有你的目的菌,但PCR的敏感性,只要有很微量的目的菌就可以P的出来,但不代表里面就没有其他的菌了,所以说菌液可能不纯,里面只有少量的阳性菌。P是P的出来,但酶切就出不来”
8楼2009-11-05 19:28:35
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zhouxw125

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-11-1 16:58:
1、M13通用引物做了菌液pcr检测阳性克隆后又用你自己的引物检测过了吗?
2、测出来的1000多bp是一个测序反应的长度,你可以再反向比对下看看有没有正确的。

恩,用我自己的引物和M13都做了检测,两个结果差不多,只有一个不一样
我再去看一下中间的序列,这个我还真没有分析咯
谢谢你,非常感谢
9楼2009-11-05 19:44:20
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pidou

木虫 (正式写手)


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是不是连接引物出的问题啊??
10楼2009-11-05 19:44:45
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