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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于测序，空载体
汕头大学海洋科学接受调剂
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zhouxw125

铁虫 (初入文坛)

[交流] 关于测序，空载体

大家好！不知道有没有人遇到过这样的情况呢？

我做了连接转化后，先是用自己的引物做了菌液PCR检测，结果假阳性比较多，测出的都是空载体。然后我又用M13通用引物做了菌液pcr检测阳性克隆，送至华大基因测序，结果现在测出的序列都是载体上的序列，完全不是我要的结果，跟第一次差不多。有没有人遇到到过同样的情况呢，分享一下经验

我的目的基因片段是600bp左右，测序的几个结果都是1000多个bp，根本不是我要的序列

[ Last edited by amisking on 2009-11-1 at 14:27 ]
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1楼 2009-11-01 14:22:43
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黑罕

金虫 (小有名气)
★ ★
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amisking(金币+1,VIP+0): 11-1 16:21
你的连接有问题
1、找人检查你的实验方案是否有问题
2、检查你用的酶是否有效
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2楼2009-11-01 14:37:00
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★ ★
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amisking(金币+1,VIP+0): 11-1 16:21
呵呵，XW啊，实验出问题了才来小木虫逛啊。
还是那个原因。
菌液PCR一定要记得做阴性对照。
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Thank-you，so-blue.
3楼2009-11-01 15:17:13
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我爱吃水果

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0): 11-1 16:22
用基因特异引物检测室空载体那肯定就是空的了
没必要还用M13，更不要测序
重新挑克隆
不行只能重做连接转化
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爱学习！爱运动！我爱吃水果！o(∩_∩)o...哈哈
4楼2009-11-01 16:17:46
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
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amisking(金币+1,VIP+0): 11-1 17:09
1、M13通用引物做了菌液pcr检测阳性克隆后又用你自己的引物检测过了吗？
2、测出来的1000多bp是一个测序反应的长度，你可以再反向比对下看看有没有正确的。
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5楼2009-11-01 16:58:49
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zhouxw125

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 黑罕 at 2009-11-1 14:37:
你的连接有问题
1、找人检查你的实验方案是否有问题
2、检查你用的酶是否有效

恩，我现在正在改进实验方法，重新做一遍试试，谢谢
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6楼2009-11-05 19:25:20
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zhouxw125

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2009-11-1 15:17:
呵呵，XW啊，实验出问题了才来小木虫逛啊。
还是那个原因。
菌液PCR一定要记得做阴性对照。

哈哈，S啊，你是天天来啊，我也经常来看帖子地
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7楼2009-11-05 19:26:20
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zhouxw125

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 我爱吃水果 at 2009-11-1 16:17:
用基因特异引物检测室空载体那肯定就是空的了
没必要还用M13，更不要测序
重新挑克隆
不行只能重做连接转化

不一定啊，用基因特异性引物做检测也会有误的,原因跟M13一样。
“PCR只能说明菌液里有你的目的菌，但PCR的敏感性，只要有很微量的目的菌就可以P的出来，但不代表里面就没有其他的菌了，所以说菌液可能不纯，里面只有少量的阳性菌。P是P的出来，但酶切就出不来”
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8楼2009-11-05 19:28:35
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zhouxw125

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-11-1 16:58:
1、M13通用引物做了菌液pcr检测阳性克隆后又用你自己的引物检测过了吗？
2、测出来的1000多bp是一个测序反应的长度，你可以再反向比对下看看有没有正确的。

恩，用我自己的引物和M13都做了检测，两个结果差不多，只有一个不一样
我再去看一下中间的序列，这个我还真没有分析咯
谢谢你，非常感谢
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9楼2009-11-05 19:44:20
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pidou

木虫 (正式写手)
★
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是不是连接引物出的问题啊？？
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10楼2009-11-05 19:44:45
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