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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pcDNA3.1双酶切
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临药药

新虫 (初入文坛)
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pcDNA3.1双酶切
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双酶切为什么切不开啊？怀疑自连在切的时候加了SAP，也还是切不开。电泳后看到不加酶的质粒跑在前面一小段，是不是说双酶切切开了一边？希望各位给点建议，谢谢！
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1楼 2025-02-19 23:18:00
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tianyu1201

木虫 (著名写手)
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双酶切你要确认一下用的两个酶反应体系或者说buffer和温度等一致。如果是两个完全不同的位点是可以切开的赛默飞和neb的我都只用同品牌，问题不大。线性化载体切出来的跑电泳就会比环状质粒跑的慢，大小有区别是正常的。空线性化载体切掉的部分不会很大，正常来说从电泳上看不出来单酶切和双酶切片段的区别。切胶回收以后是插入片段连不上去还是长插入片段总是突变，让你得到没切开的结论？
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9楼2025-02-20 02:39:48
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临药药

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by tianyu1201 at 2025-02-20 02:39:48
双酶切你要确认一下用的两个酶反应体系或者说buffer和温度等一致。如果是两个完全不同的位点是可以切开的赛默飞和neb的我都只用同品牌，问题不大。线性化载体切出来的跑电泳就会比环状质粒跑的慢，大小有区别是正常 ...

没有胶回收，只是看跑的条带，不加酶的质粒跑在前面一点点。两个酶都是takara的，都是37°，分别切了2小时也切不开。会不会是质粒连上的这个基因不太好切了？
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10楼2025-02-20 08:30:46
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tianyu1201

木虫 (著名写手)
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10楼: Originally posted by 临药药 at 2025-02-20 08:30:46
没有胶回收，只是看跑的条带，不加酶的质粒跑在前面一点点。两个酶都是takara的，都是37°，分别切了2小时也切不开。会不会是质粒连上的这个基因不太好切了？
...

你切的目的是连接还是验证？连接的话进去的片段多大？
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11楼2025-02-20 11:23:51
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tianyu1201

木虫 (著名写手)
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10楼: Originally posted by 临药药 at 2025-02-20 08:30:46
没有胶回收，只是看跑的条带，不加酶的质粒跑在前面一点点。两个酶都是takara的，都是37°，分别切了2小时也切不开。会不会是质粒连上的这个基因不太好切了？
...

就算是同一品牌也会有普通酶和快切酶的区别啊，buffer什么的可能会存在不一致的情况，要确认buffer货号的。另外，如果是为了验证，可以试一试菌液PCR，单克隆能扩出来合适大小的片段的也可以直接送测序验证啊
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12楼2025-02-20 11:26:25
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nono20093楼
2025-02-19 23:24   回复  
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tzynew2楼
2025-02-19 23:21   回复  
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麦兜12127楼
2025-02-20 00:59   回复  
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yudaoqian885楼
2025-02-20 00:01   回复  
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tianyu12018楼
2025-02-20 02:33   回复  
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秋土豆香6楼
2025-02-20 00:06   回复  
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ylc63514楼
2025-02-19 23:53   回复  
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