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活性氧（ROS）含量检测试剂盒实验解决方案 已有1人参与
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实验步骤 对于刺激时间较短（通常为2 h以内）的细胞，建议先装载探针，后用活性氧阳性对照或感兴趣的药物刺激细胞；对于需要较长时间刺激（通常为6 h以上）的细胞，建议先用活性氧阳性对照或感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针，此处仅提供后者的实验方法，具体步骤如下： 1.原位装载探针 (仅适用于贴壁细胞) a) 细胞准备：检测前一天细胞铺板，确保检测时细胞数量小于5×105个/mL。 b) 药物诱导：去除细胞培养液，加入无血清培养基稀释的药物处理细胞，于37℃细胞培养箱内避光孵育，实际诱导时间根据药物特性和细胞类型决定。 c) （选做）阳性对照：用无血清培养液稀释Positive Control (50 mM) 到常用工作浓度50 μM，加入细胞，37℃避光孵育30 min-4 h。为提高活性氧水平，不同类型细胞刺激时间存在差异，例如：HeLa细胞需处理30-60 min。 注意：（1）仅在阳性对照孔中加入，其余试验组不需要加阳性对照。（2）阳性对照推荐初始使用浓度为50 μM（推荐浓度50-250 μM，具体依细胞类型而定），工作液要现用现配，不要储存稀释后的溶液，阳性对照也可用不含酚红的10% FBS完全培养基稀释。 d) ROS探针准备：用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 μM。 e) ROS探针装载：去除处理药物，用无血清培养液洗涤细胞1-2次，加入适当体积稀释好的DCFH-DA工作液。需充分盖住细胞，例如：6孔板通常不少于1 mL/孔，96孔板通常不少于100 μL/孔，37℃细胞培养箱内避光孵育30 min。 f) 细胞清洗：用无血清培养液洗涤细胞1-2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。 2.收集细胞后装载探针 (适用于贴壁细胞和悬浮细胞) a) 细胞准备：按照标准方法培养细胞，必须保证检测用细胞状态良好。按照适当方法，清洗并收集足量的细胞。 b) 药物诱导：将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药物，于37℃细胞培养箱内避光孵育，实际诱导时间可根据药物特性和细胞类型决定。 c) （选做）阳性对照：用无血清培养液稀释Positive Control (50 mM) 到常用工作浓度50 μM，加入细胞，37℃避光孵育30 min-4 h。为提高活性氧水平，不同类型细胞刺激时间存在差异，例如：HeLa细胞需处理30-60 min。 注意：（1）仅在阳性对照孔中加入，其余试验组不需要加阳性对照。（2）阳性对照推荐初始使用浓度为50 μM（推荐浓度50-250 μM，具体依细胞类型而定），工作液要现用现配，不要储存稀释后的溶液，阳性对照也可用不含酚红的10% FBS完全培养基稀释。 d) ROS 探针准备：探针装载前，用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 μM。 e) ROS探针装载：离心收集细胞去除处理药物，并用无血清培养液洗涤细胞1-2次，离心收集细胞，加入稀释好的探针，使其细胞密度为1.0×106-2.0×107，37℃细胞培养箱内避光孵育30 min。 注意：细胞密度需根据后续的检测体系，检测方法以及检测总量来进行调整。例如：对于流式分析，单管检测内细胞数目不少于104，也不可多于106。 f) 细胞清洗：用无血清细胞培养液洗涤细胞1-2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。 3.荧光显微拍照 a) 对贴壁生长细胞（步骤1.f)，细胞清洗后，加适量的无血清细胞培养液或PBS，在荧光显微镜下观察；对悬浮生长细胞（步骤2.f)，取25-50 μL细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片。 b) 荧光显微镜下，选用FITC滤光片观察荧光，去除背景观察荧光的变化。 4.流式细胞分析操作方法 a) 对贴壁生长细胞（步骤1.f)，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞（步骤2.f)，直接收集细胞。用0.5-1 mL PBS重悬细胞(0.5-1x105/mL)； b) 流式细胞仪中，488 nm为激发波长，525 nm为发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。 注意事项 1.阳性对照推荐初始使用浓度为50 μM（推荐浓度50-250 μM，具体依细胞类型而定）。通常刺激后30 min-4 h可以观察到显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30 min内观察不到活性氧的升高，可延长诱导时间或适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果荧光信号过强，可缩短诱导时间或适当降低活性氧阳性对照的浓度。 2.实验过程中，如果阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2,000-1:5,000稀释荧光探针DCFH-DA，使DCFH-DA的终浓度为2-5 μM。探针装载的时间可在15-60 min内适当进行调整，尽量缩短读片时的曝光时间，并且试验组、对照组曝光时间需保持一致。 3.Positive Control (50 mM) 仅仅用于作为阳性对照的样品，并非所有试验组样品中都需加入活性氧阳性对照。 4.探针装载后，一定要洗净未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。 5.尽量缩短探针装载后到检测所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。 |
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