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爱吃旺旺碎冰冰

新虫 (小有名气)

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专业: 微生物学

[求助] 目的基因片段总是装载不上pMD18-T载体上，求助！！！已有1人参与

一、用高保真酶、设计的引物对细菌DNA进行PCR扩增（50μL体系共三管)，电泳后发现条带单一且无杂带
二、PCR产物纯化
三、将胶回收的DNA片段加A尾:
1.胶回收提取液与Taq酶预混物1：1混合，各为25μL（共50μL）
2.72℃退火30min
3.PCR产物纯化【纯化过程中的第二步：2.估计PCR反应液或酶切反应液的体积，向其中加入等倍体积溶液PC（此步加入30μLPC，实际上上一步PCR反应液为50μL，但误以为是30μL，所以加了30μL溶液PC与50μLPCR反应液混合均匀后就加入吸附柱中了，加完后发现加错了，又向吸附住中补加了20uL）】
四、将pMD18-T载体与已纯化的目的片段相连接：
1.1μLpMD18-T载体、5μL连接缓冲液SolutionⅠ、4μL已纯化的PCR产物加入到一个新的PCR管中混匀
2.将其放入金属浴连接槽中16℃恒温过夜，本次连接时间共计17h左右
3.将样品取出冰箱4℃保存。
五、将质粒转入感受态细胞（CaCl2转化法）:
1.从-80℃冰箱中取出一管制备好的感受态细胞Top10（100μL），立即置于冰水混合物上，将10μL制备好的质粒加入感受态细胞中，轻轻吹打混匀，将混合物置于冰水混合物中静置30min
2.将其放在42℃水浴锅中热激90s
3.将其取出再置于冰水混合物中5min，然后加入1mL新鲜LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养1h。
六、涂平板及培养：
1.制备两个氨苄抗性平板：向60mLLB固体培养基（不烫手即可）中按照1：1000的比例加入60μL氨苄抗性（原液浓度100mg/mL），轻晃混匀，倒两个平板，静止凝固
2.先吸取100μL菌液均匀涂布在氨苄抗性平板上，剩余900μL菌液11000rpm离心1min，弃去800μL上清液，剩余100μL菌液重悬，均匀涂布在另一个氨苄抗性平板上；37℃过夜培养，本次共计培养20h左右
七、挑菌落及培养：挑取平板上的单菌落（共七个）分别接种到新鲜LB液体培养基中，37℃，200rpm，过夜培养，由于操作失误，导致前20h无振荡培养，发现菌液浑浊度较低，又200rpm振荡培养了4哈，共计24h
八、菌液PCR：用Taq酶、设计的引物、菌液分别作模版进行PCR九、电泳：结果七种阳性菌液都显示有目的条带
九、任意选取一瓶菌液吸取1.5mL提取质粒：质粒小提试剂盒
十、双酶切验证目的基因片段是否成功装载上pMD18-T载体上：
1.（20uL体系）质粒10u、10xbuffer2u、Pst1 0.5u、Sac1 0.5u、ddH2O7u混合；38摄氏度恒温培养箱温育1h10min；
2.电泳：结果显示无条带
这是我用这种方法（试剂的用量、步骤都一样）将目的片段装载到T载体的第三次实验了，前两次用的引物不是设计的引物，而是从文献中筛选到的引物，目的是想通过装载T载体上，测序出目的片段两端的未知序列，但通过测序结果都显示空载，都没有成功装载了，后面通过全基因比对出了目的片段的两端序列，即从全基因中找出了目的基因的完整序列，之后又通过软件重新设计引物（可以扩增出完整目的片段），然后就做了上述步骤，只不过没有测序，而是通过双酶切检验是否成功装载到T载体上，还是没有装载上。
拜托大佬请教一下几个问题：
1.做了这三次实验最后菌液PCR电泳后都显示有目的条带，前两次有一次还做了质粒PCR电泳后也显示有条带啊，但是就是进一步验证测序显示空载，包括这次双酶切电电泳后显示无条带，我想知道这是哪里出问题了？电泳验证都显示有条带，但最后进一步验证还是空载，那电泳显示有条带是咋回事？难道电泳这么不靠谱吗？难道以后我都要再测序或者双酶切进一步验证吗？
2.哪些具体步骤可能导致我一直装载不上T载体？
3.我该如何优化实验让目的片段成功装载到T载体上呢？
4.以上步骤所有用到的酶，我都是从冰箱里拿出来，也没有放在冰上加，直接放在离心管架上加的，这会对最终实验结果有影响吗？

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